本试剂盒仅供科研使用
糖化酶(Glucoamylase)试剂盒说明书
(货号:WS9650F 分光法 24 样)
一、产品简介:
糖化酶,又称葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3),是一种外切型糖苷酶,它从淀粉的非还原性
末端水解α-1,4 糖苷键和α-1,6 糖苷键,将淀粉完全水解为葡萄糖,因此广泛的应用于酒精、
白酒、抗生素、氨基酸、有机酸,甘油,淀粉糖等工业中,是我国重要的工业酶制剂之一。
糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖,与 3,5-二硝基水杨酸生成红棕色化合物,在 540nm
处有最大光吸收,在一定范围内反应液颜色深浅与葡萄糖的量成正比,可测定计算得糖化
酶的活力。
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉体 mg×1 瓶
4℃保存
临用前用提取液于 80℃水浴溶
解,并定容至 10mL。
试剂二
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、水浴锅、台式离心机、可调式移液
器、研钵、冰。
四、糖化酶活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min,取上
清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取
② 细胞样本:
先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细胞加入 1mL 提取液;超声波破
碎细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);4ºC 约 12,000rpm
离心 10min,取上清作为待测样品。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温;
③ 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(
μL)
测定管
对照管本试剂盒仅供科研使用
2
样本
30
煮沸样本
30
试剂一
300
300
充分混匀,40℃反应 20min
试剂二
600
600
混匀,沸水浴(95-100℃)5min,流水冷却后,全部转移
至 1mL 玻璃比色皿中,于 540nm 处读取吸光值 A,△A=A
测定-A 对照(每个样本自身需做一个自身对照)。
【注】:1. 若ΔA 过小,可以延长 40℃反应时间 T(如:40min 或更长),或增加样本量 V1(如增至
60μL,则试剂二相应减小),重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
2. 若 A 值大于 1.8,可缩减 40℃反应时间 T(如:10min 或更短),或减少样本量 V1(如减
至 10μL,则试剂二相应增加),重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y= 0.0139x-0.0443,x 是标准品质量(
μg),y 是ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算:
定义:每毫克组织蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生 1μg 葡萄糖所需酶量为一个酶活单位。
糖化酶活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0443)÷0.0139]÷(V1×Cpr) ÷T=119.9×(ΔA+0.0443)÷Cpr
3、按样本鲜重计算:
定义:每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生 1μg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0443)÷0.0139]÷(W×V1÷V) ÷T=119.9×(ΔA+0.0443)÷W
4、按细胞数量计算:
定义:每 104个细胞每分钟分解可溶性淀粉产生 1μg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(nmol /min /104 cell)=[(ΔA+0.0443)÷0.0139]÷(500×V1÷V)÷T=0.24×(△A+0.0443)
5、按照液体体积计算:
定义:每毫升液体每分钟分解可溶性淀粉产生 1μg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(nmol /min /104 cell)=[(ΔA+0.0443)÷0.0139]÷V1÷T=119.9×(ΔA+0.0443)
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.03 mL;
W---样本质量,g;
T---反应时间,20min;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(4mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天
内用且-20℃保存)。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4 mg/mL。也可根据实际
样本来调整标准品浓度。
3 依据测定管加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。