本试剂盒仅供科研使用
6-磷酸山梨醇脱氢酶(Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase)活性试剂盒说明书
(货号:WS5750W 微板法 96 样)
一、产品简介:
6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH,EC 1.1.1.200)又称醛糖 6-磷酸还原酶(Aldose-6-phos
-phate reductase,A6PR),催化 D-山梨糖醇 6-磷酸和 D-葡萄糖 6-磷酸之间的相互转化。研
究发现该酶在苹果叶片等蔷薇科植物中广泛分布,其在山梨醇合成中起着重要作用。
6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)催化 D-葡萄糖 6-磷酸还原,并使还原型辅酶Ⅱ(NADPH)
氧化。因此,通过检测 340nm 下 NADPH 的下降速率,即可得出 S6PDH 的酶活性大小。
该酶催化的反应:D-sorbitol 6-phosphate+NADP+=D-glucose 6-phosphate+NADPH+H+
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 100mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×2 支
4℃保存
用前甩几下或离心使粉剂落入底部,
每支分别加 0.6mL 蒸馏水溶解备用。
用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止
反复冻融,三天内用完。
试剂二
液体 20mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
粉剂 mg×1 支
4℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部,再加
1.1mL 蒸馏水溶解备用。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰。
四、6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
称取约 0.1g 组织样本,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心 10min,
取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 在 96 孔板中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
样本
10
试剂一
10
试剂二
170
混匀,室温(25℃)下孵育 10min
试剂三
10
混匀,室温(25℃)下,于 340nm 处读取 A1,
10min 后读取 A2。ΔA=A1-A2。
【注】 1.若 10s 后反应体系未稳定可延长到 1min 再读值。
2.若△A 在零附近,可适当延长反应时间 T 至 20min 或更长读取 A2,或适当加大样本量 V1本试剂盒仅供科研使用
2
(如增至 20μL,则试剂二相应减少),则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
4. 若起始值 A1 太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高,则起始值相对会偏
高),可以适当减少样本加样量 V1,则改变后的 V1 需代入计算公式重新计算。
或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min,上清液用于检测;
5. 若ΔA 大于 0.25,需减少反应时间 T(如减至 5min),则改变后的 T 需代入公式重新计算。
6. 若下降趋势不稳定,可以每隔 30S 读取一次吸光值,选取一段线性下降的时间段来参与计
算,相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、按样本蛋白浓度计算
单位定义:每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
S6PDH 活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T
=643.1×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算
单位定义:每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
S6PDH 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T
=643.1×ΔA÷W
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.01mL;
V2---反应体系总体积,2×10-4 L;
d---96 孔板光径,0.5cm;
ε---NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;
W---样本质量,g;
T---反应时间,10min;
Cpr---蛋白浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。