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- 2026年01月12日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃保存，应避免反复冻融。
- 保质期：
12个月
- 英文名：
Diphtheriabacillus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
- 库存：
按需
- 供应商：
中创汇科
- 规格：
25T/盒 、50T/盒
产品名称：白喉杆菌双重核酸检测试剂盒（探针法）
产品规格：25T/盒、50T/盒
产品货号：ZC-RTPCR-275
【预期用途】
本试剂盒用于鼻腔分泌物、咽喉拭子等样本及增菌液中白喉杆菌的定性检测。检测结果仅供临床参考和科学研究用途，不得单独作为临床诊断或排除病例的依据。
【适用仪器】
ABI 7500、Stratagene 3000P/3005P、Gentier 96、Bio-Rad CFX96 Touch、Roche LightCycler480、SLAN-96P 实时荧光定量 PCR 仪。
【检验原理】
本试剂盒针对白喉杆菌高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含白喉杆菌基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成分】
| 组份 |
50T |
25T |
| 1. DNA 提取液 |
2 管（1.5 mL×2） |
1 管（1.5 mL） |
| 2. 白喉杆菌（ToxA/ToxB） PCR 反应液 |
2管（487.5μL×2） |
1管（487.5μL） |
| 3. 白喉杆菌（ToxA/ToxB）混合酶液 |
1 管（25μL） |
1 管（12.5μL） |
| 4. 阴性对照 |
1 管（30μL） |
1 管（30μL） |
| 5. 白喉杆菌（ToxA/ToxB）阳性对照 |
1 管（30μL） |
1 管（30μL） |
| 6. 说明书 |
1 份 |
1 份 |
注：不同批次试剂盒成分不可混用！
【样本要求】
1.本试剂盒根据病型采取鼻腔分泌物、咽喉拭子等作为检测样本。
2.咽喉拭子：操作者一手持压舌板压住病人舌后根，另一手拿住无菌拭子根部，然后将沾湿的无菌拭子左右两面及拭子头部快速且较用力地分别刮取扁桃腺两侧及咽后壁的分泌物。将咽喉拭子放入盛有 1~3mL 生理盐水或病毒保存液的采集管中备用。
3.如需在增菌后进行 PCR 检测，则应使用选择性增菌液对原始样本进行增菌。
4.应避免样本间交叉污染。
5.样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃ 以下。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
细菌培养物样本：取1mL 增菌菌液或 1mL菌悬液（生理盐水或 1×TE）加入到 1.5mL 无菌离心管中，8000 rpm 离心 5 min后弃上清，保留沉淀，加入 DNA 提取液50μL，将沉淀悬浮后 100℃加热处理5min，12000 rpm 离心 2 min，取上清进行 PCR 检测。
1.2 DNA提取
建议使用商品化的DNA 提取试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
核算当次实验所需要的反应数(n)，并根据表 1 反应体系配制方法 计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数(1T) +阳性对照数(1T) +误差预留量+样本数
表 1：反应体系配制方法
| 单反应体系 配方 |
白喉杆菌（ToxA/ToxB） PCR 反应液 |
19.5 μL |
| 白喉杆菌（ToxA/ToxB）混合酶液 |
0.5 μL |
3. 加样（样本处理区）
将步骤1提取的DNA、阳性对照、阴性对照各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4. PCR扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息；
表 2：仪器核酸扩增相关参数
| 体系 |
反应体系设为 25μL |
||
| 信号 采集 |
白喉杆菌 ToxB 基因—FAM 通道采集荧光信号； 白喉杆菌 ToxA 基因—HEX/VIC/JOE 通道采集荧光信号。 |
||
|
PCR 反应 条件 |
阶段 |
条件 |
循环数 |
| UNG 处理 |
50℃：2min |
1 |
|
| 预变性 |
95℃：3min |
1 |
|
|
PCR |
95℃：5s |
40 |
|
| 55℃：30s （此阶段结束时采集荧光信号） |
|||
注：ABI 系列荧光定量 PCR 仪不选 ROX 校正，淬灭基团选 None。
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2 对照标准
阳性对照：Ct 值≤30，有明显指数增长。
阴性对照：Ct 值＞37.5或无 Ct 值，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和平台期。
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
5.3 结果判断
阳性：样本检测结果 Ct 值≤34.5，有明显指数增长。
可疑：样本检测结果 Ct 值在34.5～37.5 范围。此时应对样本进行重复检测，如重复实验结果 Ct 值仍在34.5～37.5 范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。
阴性：样本检测结果 Ct 值＞37.5或无 Ct 值。
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性引物。在引物探针设计时就需要特别考虑扩增片段不能太长，否则那些降解的RNA片段无法被检测到，导致得到的结果不准确。 QIAGEN 全新发布的TaqMan引物探针 - QuantiFast Probe Assays就特别考虑到了 另外由于FFPE样品中的核酸高度片段化且相互交联，抽提得到的RNA中有较多的基因组DNA片段残留，这些残留的gDNA也会被扩增出来，严重影响了基因表达分析结果的真实性。 QIAGEN 全新发布的探针法检测试剂盒 -QuantiFast Probe RT
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