本试剂盒仅供科研使用
葡萄糖氧化酶(GOD)活性测定试剂盒说明书
(货号:WS1950W 微板法 96 样)
一、产品简介:
葡萄糖氧化酶(GOD,EC 1.1.3.4)是一种常见于多种微生物中的氧化还原酶,葡萄糖
氧化酶催化葡萄糖和氧反应生成葡萄糖酸和过氧化氢,过氧化氢和特异显色剂反应产生
(粉)红色产物,该产物在510nm有最大吸收峰,进而得到葡萄糖氧化酶酶活性大小。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 100mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 6mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
液体 10mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
粉体 mg×2 支
4℃保存
用前甩几下使粉体落入底部,每支
加 1.2mL 的蒸馏水溶解备用。
标准管
液体 mL×1 支
4℃保存
三、所需仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、天平、移液器、研钵、离心机、蒸馏水。
四、葡萄糖氧化酶(GOD)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
0.1g 组织样本(水分充足的样本建议取 0.2g 左右),加 1mL 的蒸馏水研磨,粗提液
全部转移到 EP 管中,12000rpm,4℃离心 10min,上清液待测。
② 细胞/细菌样本:
先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细胞/细菌加入 1mL 蒸馏水或 PBS
或生理盐水,超声波破碎细胞/细菌(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30
次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
2、上机检测:
1 酶标仪预热 30min,设定波长到 510nm。
2 所有室温至室温(25℃)。在 96 孔板中依次加入:
试剂名称(
μL)
测定管
试剂一
60
试剂二
100
样本
20
混匀,37℃孵育 5min
试剂三
20
混匀,于 510nm 下读取吸光值 A1,37℃孵育
20min 后读取吸光值 A2,△A =A2-A1。
【注】:若△A 值在零附近,则增加样本加样体积 V1(如增至 50μL,则试剂一相应减少),
或延长反应时间 T(如延长至 40min 或 60min),则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。本试剂盒仅供科研使用
2
五、结果计算:
1、标准曲线:y = 11.151x - 0.0212:x 为 H2O2标准品(μmoL),y 为ΔA。
2、按样本鲜重计算:
单位定义:在 37℃,每克组织每小时生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位(U)。
GOD (μmoL/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0212)÷11.151]÷(W×V1÷V)÷T =13.45×(ΔA+0.0212)÷W
3、按样本蛋白浓度计算:
单位定义:在 37℃,每毫克组织蛋白每小时生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位(U)。
GOD (μmoL/h/mg prot)=[(ΔA+0.0212)÷11.151]÷(V1×Cpr) ÷T=13.45×(ΔA+0.0212)÷Cpr
4、按细胞/细菌数量计算:
单位定义:在 37℃,每 104个细胞/细菌每小时生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位(U)。
GOD (μmoL/h/104 cell)=[(ΔA+0.0212)÷11.151]÷(500×V1÷V)÷T=0.027×(△A+0.0212)
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.02mL;
T---反应时间,20min=1/3h;
W---样本质量,g;
500---细胞数量,万;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(250μmol/mL)。
2 把母液稀释成以下浓度:0,0.5,1,1.5,2,2.5μmol/mL。也可根据实际调整浓度。
3 在 96 孔板中直接加入:20μL 标准品+80μL 试剂一+100μL 试剂二,混匀于 510nm 处
读值,依据结果即可制作标准曲线。