本试剂盒仅供科研使用
糖原磷酸化酶 a（GPa）试剂盒说明书
（货号：WS4650F 分光法 48 样）
一、产品简介：
糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代谢的关键酶，
使糖原分子从非还原端逐个断开α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放 1-磷酸葡萄糖，直至临
近糖原分子α-1，6-糖苷键分支点前 4 个葡萄糖基处。GP 分为有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa）
和无活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）两种形式。糖原的分解主要在 GPa 的催化下进行。
本试剂盒提供一种快速，灵敏和简便的检测方法，GPa 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残
基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还
原成 NADPH，接着与特异显色剂反应生成有色物质，通过检测该有色物在 450nm 的增加速
率，进而计算出 GPa 酶活性大小。
二、试剂盒组成和配制：
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部，再加
1.1mL 蒸馏水充分溶解备用。
试剂二
粉剂 mg×1 支
4℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部，再加
1.1mL 蒸馏水充分溶解备用。
试剂三
液体 2mL×1 支
4℃保存
试剂四
液体 35mL×1 瓶
4℃保存
试剂五
粉剂 mg×1 支
4℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部，再加
2.4mL 蒸馏水充分溶解备用。
标准品
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
若重新做标曲，则用到该试剂
三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液
器、研钵、冰。
四、糖原磷酸化酶 a（GPa）活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验
样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min，取上
清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取
② 细胞样本：
先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细胞加入 1mL 提取液；超声波破
碎细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm
离心 10min，取上清作为待测样品。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，设置温度 30℃,调节波长至 450nm，蒸馏水调零。
② 试剂放在 30℃水浴 5min；
③ 在 1mL 玻璃比色皿中依次加入：本试剂盒仅供科研使用
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试剂名称（μL）
测定管
样本
40
试剂一
20
试剂二
20
试剂三
30
试剂四
610
混匀，30℃条件下孵育 10min
试剂五
40
混匀，30℃条件下，1min 时于 450nm 处读取
吸光值 A1，6min 时读取 A2，△A=A2-A1。
【注】：1. 若ΔA 过小，可以延长反应时间 T（如：16min 或更长）再读取 A2，或增加样本量 V1（如
增至 80μL，则试剂四相应减小），重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
2. 若 A2 值大于 1.5，可缩减反应时间 T（如：3min 或更短）再读取 A2，或减少样本量 V1
（如减至 20μL，则试剂四相应增加），重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y = 0.0317x-0.0095，x 是标准品摩尔质量：nmol，y 是ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每毫克组织蛋白每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 为一个酶活单位。
GPa（nmol/min/mg prot）＝[(ΔA+0.0095) ÷0.0317]÷ (V1×Cpr) ÷T=157.7×(ΔA+0.0095)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
单位定义：每克组织每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
GPa（nmol/min/g 鲜重）＝[(ΔA+0.0003) ÷0.0804]÷(W×V1÷V) ÷T=157.7×(ΔA+0.0095)÷W
4、按细胞数量计算：
单位定义：每 104个细胞每分钟使 1nmol NADP+转换成 1nmol NADPH 定义为一个酶活单位。
GPa（nmol /min /104 cell)= [(ΔA+0.0003) ÷0.0804]÷(500×V1÷V)÷T=0.315×(ΔA+0.0095)
V---加入提取液体积，1 mL；
V1---加入样本体积，0.04 mL；
W---样本质量，g。
T---反应时间，5min；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（1nmol/μL）：向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水（母液需在两
天内用且-20℃保存）。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根据实际
样本来调整标准品浓度。
3 依据加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。
文献和实验
技术资料