本试剂盒仅供科研使用
谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)试剂盒说明书
(货号:WS4240F 分光法 48 样)
一、产品简介:
天冬氨酸氨基转移酶,俗称谷草转氨酶,缩写为 AST 或 GOT(EC 2.6.1.1)广泛存在
于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化可逆转氨基反应,是氨基酸代谢的重要酶。
谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)催化天门冬氨酸和α-同戊二酸发生转氨基
反应,生成谷氨酸和草酰乙酸,草酰乙酸进一步自行脱羧生成丙*酸;丙*酸可与 2,4-
二硝基*肼反应生成 2,4-二硝*苯腙,在碱性溶液中显棕红色;通过在 520nm 读取吸光
值并计算出该酶活力大小。
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 5mL×1 支
4℃保存
试剂二
液体 6mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
液体 6mL×1 瓶
4℃保存
试剂四
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、
可调式移液器、研钵。
四、谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、 样本制备:
① 组织样本:
取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心 10min,取上
清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。
2
细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,
超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000rpm,
4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例提取。
③ 血清(浆)样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机测定:
① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 520nm,蒸馏水调零。
② 可先做 2 个样本预测定,熟悉操作过程,并依据测出的吸光值 A 是否超出标准曲线的
线性范围来做调整。
3 在 1.5mLEP 管中依次加入:
试剂名称(
μL)
测定管
对照管
样本
20
试剂一
10
10
试剂二
60
60本试剂盒仅供科研使用
2
混匀,于 37℃孵育 30min
试剂三
60
60
样本
20
混匀,于 37℃孵育 10min
试剂四
600
600
混匀,25℃孵育 10min,全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿
(光径 1cm)中,于 520nm 处测定吸光值 A,
△A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。
【注】1.若 A 测定超过 1.5,可降低样本量 V1(如 10μL),试剂一相应增加。则改变后的加样
体积 V1 需代入计算公式重新计算。
2.若△A 的值在零附近徘徊,则可增加样本量 V1(如 30μL,则试剂一相应减少),或增加
样本取样质量(W),则改变后的加样体积 V1 和取样质量 W 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y = 0.0217x + 0.0039,x 为标准品摩尔质量(nmol);y 是ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 丙*酸定义为一个酶活力单位。
GOT/AST(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0039)÷0.0217]÷(V1×Cpr)÷T=76.8×(ΔA-0.0039)÷Cpr
3、按样本鲜重计算:
酶活定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol 丙*酸定义为一个酶活力单位。
GOT/AST(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0039)÷0.0217]÷(W×V1÷V)÷T=76.8×(ΔA-0.0039)÷W
4、按细菌或细胞密度计算:
酶活定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 丙*酸定义为一个酶活力单位。
GOT/AST(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0039)÷0.0217]÷(500×V1÷V)÷T=0.154×(ΔA-0.0039)
5、血清(浆)GPT 活力计算:
酶活定义:每毫升血清(浆)每分钟催化产生 1nmol 丙*酸定义为一个酶活力单位。
GOT/AST(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0039)÷0.0217]÷V1÷T=76.8×(ΔA-0.0039)
V---提取液体积,1 mL;
V1---反应体系中样本体积,0.02mL;
T---反应时间,30 min;
W---样本质量,g;
500---细胞或细菌总数,500 万;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL ;建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(20μmol/mL):加 1mL 蒸馏水溶解标准品,充分混匀。
2 把母液稀释成以下浓度:0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根据实际来调整浓度。
3 30μL 标准品+60μL 试剂二+60μL 试剂三,混匀,于 37℃孵育 10min ;再加 600μL
试剂四,混匀,25℃孵育 10min,于 520nm 处测定吸光值 A,依据结果即可制作标
准曲线。