本试剂盒仅供科研使用
抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase,AAO)试剂盒说明书
(货号:WS5020F 紫外法 48 样)
一、产品简介:
抗坏血酸氧化酶(AAO;EC 1.10.3.3)是一种含铜的酶,属“蓝铜氧化酶”家族。也是植物体内的末端
氧化酶的一种。其有助于植物对外界环境条件的适应。抗坏血酸氧化酶(AAO)直接氧化 AsA,通过测定
AsA 的氧化量,可计算该酶活力。
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
使用前摇匀
试剂一
液体 45mL×1 瓶
4℃保存
使用前摇匀
试剂二
粉体×1 支
4℃保存
用前甩几下或 4℃离心使试剂
落入试管底部,再加入 3mL 蒸
馏水充分溶解,一周内使用完。
三、所需的仪器和用品:
紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、低温离心机、可调式移液器、研钵
四、抗坏血酸氧化酶(AAO)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样
本和试剂浪费!
1、样本制备:
称取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。
12000rpm,4℃离心 15min,取上清液置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取
2、上机检测:
① 分光光度计预热 30 min,调节波长到 265 nm,蒸馏水调零。
② 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。
③ 依次在 1 mL 石英比色皿中加入:
试剂(μL)
测定管
样本
100
试剂一
850
试剂二
50
迅速混匀,30s 和 2min30s 时分别在 265nm 读值,
分别记为 A1 和 A2,△A =A1-A2。
【注】:1.若△A 的值在零附近,可以适当延长反应时间到 5min10s 读取 A2,改变后的反应时间
需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量,则改变后的加样体积需代入计算公式
重新计算。
2. 若起始值 A 太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高,则起始值相对会
偏高),可以适当减少样本加样量,则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。
3. 若下降趋势不稳定,可以每隔 10S 读取一次吸光值,选取一段线性下降的时间段来参
与计算,相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、按蛋白浓度计算
酶活定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。本试剂盒仅供科研使用
AAO(nmol/min /mg prot) = [△A÷(ε×d)×V2×109]÷(Cpr×V1)÷T= 92.25×△A÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活定义:25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
AAO(nmol/min/g 鲜重) = [△A÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T= 92.25×△A÷W
ε----AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol/cm;
d----比色皿光径(cm),1 cm;
1mol=1×109 nmol;
Cpr----上清液蛋白质浓度(mg/mL),建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;
W----样品质量;
V----提取液体积,1 mL;
V1----加入反应体系中上清液体积(mL),100μL=0.1 mL;
V2---反应体系总体积(L),1000μL=1×10-3 L;
T----催化反应时间(min),2min。若延长反应时间,则以具体时间代入公式重新计算。
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