操作步骤: (一)获得目的基因 1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 3、人工合成法:依照检索到的目的基因序列,设计合成相互重叠的单链寡核苷酸,再通过重叠延伸PCR法拼接出全长,这种方法无需模板,是目前常用的获取基因的手段之一。 (二)构建重组表达载体 1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 (三)获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 (四)诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。 2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中,37℃震荡培养至OD600 ≌0.4-1.0(最好0.6,大约需3hr)。 3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。 4、分别取菌体1ml,离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%SDS重悬,混匀,70℃10min。 5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。 公司正在热销的产品: Recombinant Mouse GAD1宿主: E.Coli标签: N-terminal His-IF2DI Tag种属: Mouse表达区间: 1-233分子量: 46.9 kDa纯度: Greater than 75% by SDS-PAGE gel analyses应用: Western Blot, ELISA性状: Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in 10 mM Hepes, 500 mM NaCl with 5% trehalose and 0.06% proclin, pH7.4溶解方法: Centrifuge the vial at 10,000 rpm for 1 minute, reconstitute at 200 μg/ml in sterile distilled water by gentle pipetting 2-3 times, don’t vortex存储: -20°C for 12 months as lyophilized; 2-8°C for 1 month under sterile conditions after reconstitution别名: GAD, GAD 67, GAD1, GAD67, Glutamate decarboxylase 1, SCP Recombinant Human KDM2A宿主: E.Coli标签: N-terminal His Tag种属: Human表达区间: 369-649分子量: 33 KDa纯度: Greater than 95% by SDS-PAGE gel analyses应用: Western Blot, ELISA性状: Lyophilized from a 0.2μm filtered solution in PBS with 5% trehalose, pH7.4溶解方法: Centrifuge the vial at 10,000 rpm for 1 minute, reconstitute at 200 μg/ml in sterile distilled water by gentle pipetting 2-3 times, don’t vortex存储: -20°C for 12 months as lyophilized; 2-8°C for 1 month under sterile conditions after reconstitution别名: [Histone-H3]-lysine-36 demethylase 1A, CXXC-type zinc finger protein 8, CXXC8, F box / LRR repeat protein 11, F box and leucine rich repeat protein 11, F box protein FBL7, F-box and leucine-rich repeat protein 11, F-box protein FBL7, F-box protein Lilina Recombinant Human APCSMRS2中文名称: MRS2蛋白抗体交叉反应: Human, Mouse, Rat, Pig, Cow, Horse, Rabbit, Sheep, Cat HBP1中文名称: HMG盒区内含蛋白1抗体交叉反应: Human, Mouse, Rat, Chicken, Dog, Pig, Cow, Horse, Rabbit, Sheep RAB7A中文名称: RAS癌基因相关蛋白RAB7抗体交叉反应: Human, Mouse, Rat, Dog, Pig, Cow, Horse, Rabbit, Sheep Phospho-FAK (Tyr576 + Tyr577)中文名称: 磷酸化粘着斑激酶抗体交叉反应: Human, Mouse, Rat, Chicken, Dog, Cow, Horse, Rabbit Phospho-BLNK (Tyr189)中文名称: 磷酸化T淋巴细胞连接蛋白抗体交叉反应: Human, Mouse, Rat GERP中文名称: 环指蛋白27抗体交叉反应: Human, Mouse, Rat, Chicken, Dog, Horse, Sheep