副猪嗜血杆菌定量PCR试剂盒

副猪嗜血杆菌定量PCR试剂盒
英文名称：Haemophilus parasuis Fluorescent PCR Kit
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)属巴斯德氏菌科嗜血杆菌 属，是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)且没有运动性的小型、多形性、 革兰氏阴性杆菌。HPS 可引起猪多发性浆膜炎、关节炎，严重时导致体温升 高、呼吸困难甚至死亡, 给养猪业带来巨大的经济损失。目前对 HPS 的诊断 主要是细菌分离培养和 PCR。HPS 培养需要 NAD、马血清和 5% CO2 环境， 需 24-36 小时，还容易出现杂菌污染，因此 PCR 是目前诊断 HPS 最常用的 方法。本产品就是基于 PCR 的 HPS 检测试剂盒。

产品特点：

1. 灵敏度高，分析灵敏度可以达到 50 拷贝/uL，远高于细菌培养法。
2. 特异性高，根据 HPS 的 16S rDNA 基因保守区设计引物，可扩增出强、 中和弱毒力的各种 HPS 血清型，但不会误检猪链球菌 2 型、猪伤寒/沙门 氏菌、金黄色/葡萄球菌和大肠杆菌等常见无关细菌。
3. 一管封闭式，避免了 PCR 产物对后续 PCR 的污染。
4. 线性范围广，在 10-107拷贝/uL 的靶分子浓度范围内均呈线性。
5. 简单快捷，只需要 2 小时即可得到实验结果。

副猪嗜血杆菌定量PCR试剂盒包装规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	PCR MagicMix 3.0	1 mL（红盖）
试剂二	超纯水	1 mL（亮黄色）
试剂三	副猪嗜血杆菌 PCR 引物混合液	100 μL（白盖）
试剂四	副猪嗜血杆菌 PCR 阳性对照 （1×10E8 拷贝/μL）	50 μL（黄盖）
试剂五	使用手册	1 份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其 他试剂。

自备试剂：DNA 模板


 

使用方法：

一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。
2. 如果有 N 个样品，则需要做 N+2 个提取，包括一个样品制备阳性对照和一 个样品制备阴性对照。样品制备阳性对照是在适量水（取决于试剂盒要求 的样品起始量）中加 10μL 副猪嗜血杆菌 PCR 阳性对照的 1000 倍稀释液 而得，样品制备阴性对照是直接用水。提取结束后最后得到模板 DNA 放冰 上待用。
二、设置 PCR 反应（40μL 体系）
3. 对 N+2 个样品，在 PCR 时需要增加一个 PCR 阳性对照和一个 PCR 阴性 对照，故需要设置 N+4 个反应。在 N+4 个 PCR 管中分别加入下列成分：

成分	N+2 个 样品管	PCR 阴性 对照	PCR 阳性 对照
PCR Magic Mix 3.0	各 20 μL	20 μL	20 μL
副猪嗜血杆菌 PCR 引物 混合液	各 2 μL	2 μL	2 μL
N+2 个样品 DNA 模板	各 18 μL
PCR 阴性对照（水）		18 μL
PCR 阳性对照（副猪嗜血杆菌 PCR 阳性对照的 1000 倍稀释液）			18 μL

4. 按下表设置 PCR 反应：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR 反应 （35 个循环）	95℃	30 sec
	55℃	30 sec
	72℃	30 sec
最后延伸	72℃	7 min

三、电泳检测 5. 取 10-20 μL PCR 产物。1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。本产品提供的 PCR Mix 在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。阳性对照必须有预期条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实 验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释 10 倍后重复 PCR 扩增以排 除 PCR 抑制剂的感染。


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