鼠胰腺癌类器官培养基试剂盒

试剂盒产品信息

	产品组成	规   格		储存条件及周期
		100Kit	500kit
1	类器官培养基 A	100ml	500ml	在-20℃可保存12个月，使用时在4℃冰箱缓慢融化；储存于 2-8℃，有效期3个月
2	原代培养缓冲液  B	250ml	500ml*2	4-20℃ ，2 year
3	原代组织消化液 C	30ml	150ml	4-20℃ ，1 year
4	类器官传代消化液  D	30ml	150ml	4-20℃ ，1 year
5	组织保存液 E	100ml	500ml	4-20℃ ，1 year
6	类器官冻存液  F	20ml	100ml	4-20℃ ，2 year
7	类器官传代培养缓冲液  G	250ml	500ml*2	4-20℃ ，2 year

操作步骤：
1、  原代
(1)   取材后的组织须放在预冷的(2 - 8℃) 含有组织保存液 E 的取样瓶中，快速转运 至洁净实验室进行组织处理和细胞分离，拍照并登记信息。
(2)   准备若干培养皿，加入 4℃预冷的原代培养缓冲液 B 备用
(3)   取样瓶消毒，将组织放入培养皿中，利用原代培养缓冲液 B  清洗三次后，利用眼科剪 或手术刀将肿瘤组织剪切成体积约为 1~3 mm3   的组织块。
(4)   组织用原代组织消化液 C 消化， 37℃震荡消化 10-20 min，(消化过程中随时观察 消化情况) 。
(5)   取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70μ m  以下的细胞簇后， 加入三倍体积原代培养缓冲液 B 终止消化。
(6)   使用 100μm 孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，于 300g 富集离心 5min 后移去上清， 添加原代培养缓冲液 B 重新重悬离心。
(7)   基质胶计算：第 6 步后观察收集到的组织体积， 添加 25-30 倍组织体积的基质胶重悬铺 板。
(8)   24 孔细胞培养板为例， 每孔点胶 25ul 组织基质胶混合物进行铺板(4℃下操作)。
(9)   将铺好的培养板放入 37℃培养箱中 10- 15min 成胶， 添加类器官培养基 A  (恢复室 温)进行培养。
2、  类器官传代培养
(1)   移液器吸去培养基， 每孔添加 1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液 G 放置 2min。
(2)   移液抢轻柔吹打基质胶，收集在 15ml 离心管中， 4℃静置 10min 。  (每 6-8 孔为一组)
(3)   :
3.1 类器官数量不足或体积较小时：  离心 5min 弃去上清，添加适量类器官传代培养缓 冲液 G 重悬移入 1.5ml 离心管， 300g 离心 5min 弃去液体进行第 4 步。
3.2 类器官数量较多或体积较大时： 离心 5min 弃去上清， 添加适量类器官传代消化液 D
消化 2-3min，添加类器官传代培养缓冲液 G 终止消化，离心 5min 弃去混合液，添加适量类 器官传代培养缓冲液 G 重悬移入 1.5ml 离心管， 300g 离心 5min 弃去液体进行第 4 步。
(4)   类器官收集后， 添加基质胶重悬， 每孔 25μl 基质胶铺在 24 孔细胞培养板中， 放置培养 箱中 10- 15min 添加 500μl 类器官培养基 A。
3、  类器官冻存
(1)   移液器吸去培养基， 每孔添加 1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液 G 放置 2min。
(2)   移液抢轻柔吹打基质胶，收集在 15ml 离心管中， 4℃静置 10min 。  (每 6-8 孔为一组)
(3)      离心 5min 弃去上清，添加适量类器官传代培养缓冲液 G 再次重悬， 300g 离心 5min 弃 去液体。
(4)   添加适量类器官冻存液 F，轻柔吹打重悬，以 24 孔细胞培养板为例： 密度为 2 个孔冻 存 1 管，每管体积 1.4ml。
(5)   做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存，
4、  类器官复苏
(1)   取 10ml 类器官传代培养缓冲液 G 于 15ml 离心管中
(2)   从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。
(3)   水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管， 以确保冻存液在 1-2  分钟内完全融解。
(4)   将溶解后的类器官细胞快速转移至 15ml  离心管， 使用移液管轻轻吹打 6-8 次，300g  离心 5  分钟，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量类器官传代培养缓冲液 G 重悬移入 1.5ml 离心管 300g 离心 5min。
(5)   基质胶重悬，每孔 25μl 基质胶铺在 24 孔细胞培养板中，放置培养箱中 10- 15min 成胶， 添加 500μl 类器官培养基 A。