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- 2025年12月01日
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使用SkillPak预装柱实现快速稳健的层析工艺放大
东曹SkillPak预装柱平台可从5 mL层析柱无缝放大到200 mL层析柱。借助该平台，使用少量的样品和耗材即可设计层析工艺。一旦在小试规模下确定了最佳条件，其工艺过程即可轻松转至大规模应用。
01使用AEX和CEX分离蛋白质标准品
为了展示SkillPak出色的放大能力，我们使用了不同尺寸的层析柱（分别装填了TOYOPEARL NH2-750F和Sulfate-650F填料）分离两种不同的蛋白质标准品。图1和图2是分离蛋白质标准品时UV信号的比较结果。
图1 不同尺寸SkillPak (装填了TOYOPEARL NH2-750填料)分离蛋白质标准品
图2 不同尺寸SkillPak (装填了TOYOPEARL Sulfate-650F)分离蛋白质标准品
分离结果显示，不同尺寸层析柱上其洗脱曲线相似。线性盐梯度下，随着净表面电荷的增加，蛋白质逐渐脱落。不论何种情况，均可观察到随着柱体积的减小，保留体积向右移动。这主要是因为系统死体积的不同影响，导致作为参比CV时，保留体积更高
02牛血清白蛋白 (BSA) 的动态吸附载量
我们还在装填了TOYOPEARL NH2-750填料的5 mL、50 mL和200 mL的SkillPak层析柱上测定了BSA的动态吸附载量。
表1. 不同尺寸SkillPak上BSA的动态吸附载量
BSA在不同尺寸的层析柱上的DBC值非常接近，最大偏差为4%，表明吸附能力与层析柱尺寸无关，这一点对于工艺放大时的上样量来说非常重要。
我们可以通过小试验证确认其吸附能力，节省样品和缓冲溶液。随后，即可确定使用大型层析柱时所需的载量和最大上样量。
03 BSA的洗脱曲线
图3显示了不同尺寸SkillPak层析柱上BSA的洗脱曲线，证明了层析柱尺寸并不影响洗脱曲线。色谱图wan美重叠。wei一的区别是，最小柱体积的保留体积的偏移，这主要是因为系统死体积的不同影响所致。
图3. 不同尺寸SkillPak上BSA的洗脱曲线
如您想了解SkillPak预装柱的详细信息，欢迎联系我们索取产品资料。
使用SkillPak预装柱实现快速稳健的层析工艺放大
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文献和实验1. 去垢剂类型和特点表 常用的去垢剂大概有十几种，根据膜蛋白分子量可选用下面两根预装柱进行快速筛选： 表 2. 用两根预装柱快速筛选去垢剂结果表 运行流速设为 0.5 mL/min，15 min 以内就可以筛选一个去垢剂，而且上样量 5-50μL，可节省样品。 标签 摸索得到合适的去垢剂之后，就可以进行常规的层析实验。 增溶之后，高速离心取上清过亲和层析柱，为了减少后续的处理步骤，往往设计较小的标签，一般使用 HIS 或者 Strep，如果使用 GST 标签，则需要引入酶切位点。 标签
，凝胶过滤层析主要可以分为以下三种方法 ： ● 制备级凝胶过滤纯化：对于分辨率有较高的要求： （1）上样体积一般在柱体积的 0.5%～4% ； （2）运行较低的流速 ； （3）使用较高的柱子（一般 ≥ 60 cm）。 经过纯化后的样品将被直接置换到合适的缓冲液条件中，用于后续的实验或储存。 ● 分析型凝胶过滤层析：对于分辨率有很高的要求，上样体积一般在柱体积的 0.3%～0.5% ，使用柱子的高度一般为 30 cm。而在快速纯度检测和筛选实验中，常用的是 15 cm 柱高的柱子，可以在提供足够
用蛋白或多肽标签融合于重组蛋白中，进而方便重组蛋白的纯化和检验。小分子标签通常免疫原性较低，且不影响目标蛋白功能而得以保留。但是大分子标签如 GST 因其对目标蛋白的结构和生物活性有所影响，通常需要去除。 今天我们就来聊一聊柱上酶切那点事儿~ 什么是柱上酶切 柱上酶切纯化路线是指在吸附了标签蛋白的层析柱上添加蛋白酶进行在位去除标签，具有更加灵活、高效、快速的特点。 相比于常规的洗脱后的酶切纯化路线，柱上酶切不仅可以简化酶切后的再次上样操作，同时可以尽量避免操作过程中目标
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