1×Annexin V Binding Buffer:取 1 mL Annexin V Binding Buffer (10×)加入 9 mL 去离子水中混匀。
实验操作
一步法
1. 细胞按照实验方案进行凋亡诱导,300 ×g 离心 5 min,弃上清,收集细胞,PBS 洗涤一次,轻轻重
悬细胞并计数。
2. 取 1~5 × 105 重悬的细胞,300 ×g 离心 5 min,弃上清。用 PBS 洗涤细胞一次,离心后弃上清,加
入 500 μL 稀释的 1 × Annexin V Binding Buffer 重悬细胞。
3. 细胞悬液中加入 5 μL 的 Annexin V-FITC Reagent 和 5 μL 的 PI Reagent (50μg/mL)。
4. 轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育 15~20 min。
5. 立即上机检测。如不能及时检测,请于冰上避光静置并于 1 小时内完成检测。
注:流式细胞仪检测时 Annexin V-FITC 可用 FITC 通道,PI 优先选择 PerCP/Cy5.5 通道,其次是 ECD 通道。
两步法
1. 细胞按照实验方案进行凋亡诱导,300 ×g 离心 5 min,弃上清,收集细胞,PBS 洗涤一次,轻轻重
悬细胞并计数。
2. 取 1~5 × 105 重悬的细胞,300 ×g 离心 5 min,弃上清。用 PBS 洗涤细胞一次,离心后弃上清,加
入 100 μL 稀释的 1 × Annexin V Binding Buffer 重悬细胞。
3. 细胞悬液中加入 2.5 μL 的 Annexin V-FITC Reagent 和 2.5 μL 的 PI Reagent (50μg/mL)。(由于两步法
分辨率更高,染色液用量减半依然可得到媲美一步法的效果;用户亦可根据自己的模型进行滴定后
加入适量的染色液,用更少的量获得高质量的结果。)
4. 轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育 15~20 min。
5. 加入 400 μL 稀释的 1 × Annexin V Binding Buffer,混匀样本。
6. 立即上机检测。如不能及时检测,请于冰上避光静置并于 1 小时内完成检测。
注:流式细胞仪检测时 Annexin V-FITC 可用 FITC 通道,PI 优先选择 PerCP/Cy5.5 通道,其次是 ECD 通道。
注意事项
1. 本产品仅供科研使用。
2. 检测贴壁细胞时,需收集诱导凋亡后产生的悬浮细胞,并与后续收集的贴壁细胞一起检测。
3. 应尽量避免消化贴壁细胞带来的机械损伤。同时,胰酶的消化液中应尽量不含 EDTA,因为 EDTA
会影响 Annexin V 与磷脂酰丝氨酸的结合。
4. 如果使用含 EDTA 的胰酶,收集细胞后应充分清洗,确保 EDTA 被去除干净。
5. 染色后宜尽快检测,时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
6. 荧光物质均易发生淬灭,在进行荧光观察时,尽量缩短观察时间,同时在操作和存放过程中也尽
量注意避光保存。
7. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作