Ezmax®“一步法快速克隆试剂盒”可用于无缝克隆外源 DNA 片段:简单、快速、 高效。该方法不依赖于任何限制性内切酶,可将任何外源 DNA 片段定向克隆至任意载体的任意位 点(特殊情况,如有毒基因的克隆或插入外源 DNA 后导致质粒本身不稳定等除外)。因此,在基因克隆、DNA 拼接和 DNA 定点突变等领域有广泛用途。
在靶标载体上选择合适的克隆位点,对克隆载体进行线性化处理。如果可以选择的话,建议尽量 选择无重复序列、无高级结构且 GC 含量在 40%~65%之间的区域用于外源 DNA 的克隆。常用的载 体线性化方法包括:限制性内切酶酶切和设计反向引物进行 PCR 扩增制备。
4.2 酶切法制备线性化克隆载体
如果有合适的酶切位点,建议使用该方法,整个操作流程也比较简单。其中,双酶切比单酶切更 好。酶切后,可以取少量酶切产物进行电泳,以确保全部载体被切开。对于绝大部分酶,可以对 酶切产物进行 65° C 高温 20 min 灭活,然后直接用于后续无缝拼接反应,而无需对酶切的载体进行 胶回收或过柱回收等处理。