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谷丙转氨酶(GPT)活性测定试
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69
GPT
/
1年
上海烜雅生物科技有限公司
2-8℃
100管/48样
谷丙转氨酶(GPT)活性测定试剂盒说明书微量法100管/48样注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义:GPT(EC 2.6.1.2)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化氨基酸和酮酸转氨基反应,在氨基酸代谢中具有重要作用。此外,哺乳动物肝细胞GPT活性很高,当肝细胞坏死,GPT释放到血液中,血清GPT活性显著增高。因此,GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。测定原理GPT催化丙氨酸和α-酮戊二酸发生转氨基反应,生成丙/酮酸和谷氨酸;加入2,4-二硝基/苯/肼溶液,不仅终止上述反应,而且与酮酸中的羰基加成,生成丙/酮酸苯腙;苯腙在碱性条件下呈红棕色,可以在505nm读取吸光值并计算酶活力。试验中所需的仪器和用品:可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制提取液:60mL×1瓶,4℃保存。试剂一:液体2.5 mL×1瓶, 4℃保存;试剂二:液体2.5 mL×1瓶, 4℃保存;试剂三:液体25 mL×1瓶,4℃保存;样品测定的准备1、细菌、细胞或组织样品的制备:细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。2、血清(浆)样品:直接检测。测定步骤
分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至505nm,蒸馏水调零。
在EP管或在96孔板中加入下列试剂
试剂名称(μL)
测定管
对照管
待测样本
10
煮沸10min的待测样本
试剂一
25
蒸馏水
混匀后,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应20min
试剂二
试剂三
240
混匀,室温(25℃)放置10min,在505nm波长处测各管吸光度A。ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。计算a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、标准条件下测定的回归曲线, y = 0.4228x+0.0003 (x为标准品浓度,umol/mL;y为ΔA)。2、血清(浆)GPT活力的计算单位的定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1nmol丙/酮酸定义为一个酶活力单位。GPT(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0003)÷0.4228÷T×103=118.26×(ΔA-0.0003)3、细胞、细菌和组织中GPT活力的计算(1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙/酮酸定义为一个酶活力单位。GPT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0003)÷0.4228×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =118.26×(ΔA-0.0003)÷Cpr需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。(2) 按样本鲜重计算:单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol丙/酮酸定义为一个酶活力单位。GPT(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA-0.0003)÷0.4228×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =118.26×(ΔA-0.0003)÷W(3)按细菌或细胞密度计算:单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙/酮酸定义为一个酶活力单位。GPT(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0003)÷0.4228×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.236×(ΔA-0.0003)V1:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V2:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,20min;Cpr:蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;103:1umol/mL=103 nmol/mL。b.使用96孔板测定的计算公式如下:1、标准条件下测定的回归曲线, y = 0.2114x+0.0003 (x为标准品浓度,umol/mL;y为ΔA)。2、血清(浆)GPT活力的计算单位的定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1nmol丙/酮酸定义为一个酶活力单位。GPT(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0003)÷0.2114÷T×103=236.5×(ΔA-0.0003)3、细胞、细菌和组织中GPT活力的计算(1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙/酮酸定义为一个酶活力单位。GPT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0003)÷0.2114×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =236.5×(ΔA-0.0003)÷Cpr需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。(2) 按样本鲜重计算:单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol丙/酮酸定义为一个酶活力单位。GPT(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA-0.0003)÷0.2114×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =236.5×(ΔA-0.0003)÷W(3)按细菌或细胞密度计算:单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙/酮酸定义为一个酶活力单位。GPT(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0003)÷0.2114×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.473×(ΔA-0.0003)V1:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V2:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,20 min;Cpr:蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;103:1umol/mL=103 nmol/mL。
标准曲线线性范围为:0.01 umol/mL -2 umol/mL。
ΔA线性范围为:0.01 -1。
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71 人阅读发布时间:2023-03-09 14:04
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