登革病毒4型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

产品名称：Dengue Virus(DENV)
规格：50T/盒

【产品简介】：
登革病毒4型该RT-PCR试剂中的耐热反转录酶具有卓越的热稳定性，在55℃条件下仍然保留90%以上的聚合活性。制品中的Fast Taq DNA聚合酶采用专有的热启动技术确保55℃以下没有任何活性，因此可在室温建立反应体系。Fast Taq DNA聚合酶具有卓越的扩增速度，因此满足快速PCR程序，通常在30min以内可以完成扩增反应。同时该聚合酶具有耐受杂质的能力，同样适用于粗制核酸样本的扩增反应,其检测结果仅供参考。本产品不提供活体样品做阳性对照，仅提供人工合成的特异性DNA片段标准品作为阳性对照，仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗用途。
【检验原理】：
本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，设计一对登革病毒4型特异性引物，结合一条特异性探针，用一步法荧光RT-PCR技术对登革病毒4型的核酸进行体外扩增检测。
【PCR实验常见问题】为何空白对照会出现目的扩增产物（假阳性）？如何避免？
空白对照出现目的扩增产物，属于出现了靶序列或扩增产物的交叉污染，为避免这种情况发生，应注意以下几点：(1)实验操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。(2)除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。(3)各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
【PCR实验常见问题】无扩增产物（假阴性）的可能原因及解决方法有哪些？

可能原因	解决方法
模板含有抑制物或模板含量低	纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
Buffer对样品不合适	更换Buffer或调整浓度
引物设计不当或者发生降解	重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
反应条件：退火温度太高，延伸时间太短	降低退火温度、延长延伸时间

【包装规格及成分】：

编号	成分	规格
试剂一	登革病毒4型扩增液	50μL×1管
试剂二	登革病毒4型反应液	950uL×1管
试剂三	登革病毒4型阳性质控品(5.59E+04)	50μL×1管
试剂四	登革病毒4型阴性质控品	50μL×1管
产品说明书		1份
注： 不同批号的试剂盒组分不可交互使用。 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。 自备：无DNA/RNA酶的1.5mL离心管，0.2mL PCR反应管，滤芯吸头(规格:10μL,200μL,1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器。 禁止与其他品牌/自配的试剂混用，否则会影响使用效果。

【储存条件及有效期】：
1.试剂盒应置于-15℃以下冷冻避光储存；有效期12个月，采用泡沫盒加生物冰袋密封运输，温度不超过8℃，生产日期及有效期详见外包装盒。
2.试剂盒避免反复冻融，冻融次数不超过5次，开封后-15℃以下冷冻避光储存，不影响有效期内使用。
【适用仪器】：
ABI、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。
【标本采集】：
1.根据实际情况可采取病毒/组织/血液等样品1g作为检测样本
2.应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。
【样本保存及运输】：
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
【使用方法】：
1.样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
1)组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；
2)全血样本：待血凝固后，取血清100μL于1.5mL灭菌离心管中。
1.2核酸（RNA）提取
根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化病毒DNA/RNA提取试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。
推荐采用我们公司研发生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒
2.试剂配制（试剂准备区）
2.1从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。
2.2根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂	登革病毒4型反应液	登革病毒4型扩增液
用量（样本数为N）	19μL	1μL

2.3在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后2000 rpm离心10 s，按照20μL/管分装量将试剂分装至八联PCR反应管中。
2.4盖紧八联PCR反应管盖,并注意做好相应标识（请标记在八联PCR反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联PCR反应管盖中间，以免影响信号采集）。将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。
3.加样（样本处理区）
将步骤1.2提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。
4.PCR扩增（核酸扩增区）
4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内,并记录放置顺序；
4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；
4.3荧光通道选择：检测通道选择FAM，淬灭通道选择NONE，参比荧光选NONE。
【推荐循环参数设置】：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	50℃	15min	否
2	1 cycle	95℃	3min	否
	40 cycles	95℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

5.【结果分析判断】
5.1结果分析条件设定
设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2结果判断
l阳性：检测通道Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。
l可疑：检测通道Ct值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤38.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
l阴性：检测结果Ct值无Ct值，无明显的扩增曲线。
6.【质控标准】
l阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；
l阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤30；
l以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7.【产品性能指标】
l阴阳性参考品符合率：5份阳性参考品符合率为100％；10份阴性参考品符合率为100％。
l最低检测限：1.0×103copies/mL。
l精密度：批内、批间精密度检测Ct值的变异系数（CV）均小于等于3%。
【厂家信息】：
Ø 公司名称：上海博尔森生物科技有限公司
Ø 网址：www.bioesn.net

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！