B-27无血清添加剂；B-27添加剂（50X，不含维生素A）

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产品描述：

产品名称：B-27 添加剂（50X，不含维生素A）

中文别名: B-27 无血清添加剂

描述: B-27 添加剂是无血清添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统（CNS）神经元的生长和保持其短期或长期活性。B-27 添加剂是 50X 的液体，适和应用于大多数神经细胞培养。无维生素 A 型 B-27 添加剂为不含维生素 A 的 B-27 完全添加剂。这种去除了维生素 A 的添加剂可防止干细胞向神经细胞分化。

外观: 淡粉色澄清液体

应用: 神经细胞生长及维持；干细胞增殖及分化。

浓度: 50×

储存/保存方法: -20℃，有效期24个月。

使用方法：

一、培养基的制备
推荐使用神经元基础培养基（货号：abs9460）进行原代神经元培养。 由于 L-谷氨酰胺在水溶液中不稳定，其分解产物对细胞具有毒性，神经元基础培养基和 B-27中都未包含 L-谷氨酰胺，因此在配制培养基时须另外添加 L-谷氨酰胺。
1、置于 4°C 解冻本产品。 
2、在使用前无菌添加 2％本产品和 0.5 mM L-谷氨酰胺至神经元 基础培养基，配制成神经元完全培养基（注：下文中出现的“神经元完全培养基”即指此种添加了 B27 添加剂和 L-谷氨酰胺的神经元基础培养基，不再另行解释。） 
注意：剩余的本产品可以等分成工作 体积，并储存在-20℃。在以后的试验中根据需要解冻相应体积的本产品。避免反复冻融本产品。
3、对于原代海马神经元培养，神经元完全培养基（由前述步骤制备）需要额外补充 25μM 的 L-谷氨酸，在培养的第 4 天以后的换液 中应不再添加谷氨酸。 配置好的完全培养基，可于 2-8℃的避光保存一周。 

二、细胞培养步骤 
下列步骤已在大鼠胎儿原代海马和皮层神经元，以及神经母细胞瘤细胞系中测试。
1、用无菌的冷的 0.05 mg/mL 多聚赖氨酸水溶液包被培养表面 (玻璃或细胞培养级塑料)，每平方厘米表面使用 0.15 毫升，在室温下保温 1 小时。 
2、去除多聚赖氨酸溶液，并用无菌蒸馏水冲洗两次(须彻底清洗, 因为多聚赖氨酸对细胞有毒性)。在超净工作台中打开培养板的盖子通风，直到每个孔都完全干燥。培养板干燥后可以立即使用或在 4°C 最多保存 2 周。 
3、根据标准实验室程序或随细胞提供的说明书分离原代的大鼠神经元或解冻冻存的原代大鼠神经元。 
4、在预热的(3℃)神经元完全培养基中（如前所述的方法制备) 接种细胞，建议的细胞密度为 160 个细胞/平方毫米, 或必要时使用自行优化的细胞密度。
注意：对于海马神经元， 培养基中须添加 25μM L-谷氨酸, 参见“培养基的制备”。 
5、在 36℃ 至 38℃，含 5%二氧化碳的潮湿环境中培养（使用自然空气也是可接受的，但推荐含 9%氧气和 5%二氧化碳的气体环境） 。 
6、培养 4-24 小时后, 更换一半体积的新鲜培养基，继续在培养箱中培养。
7、对海马神经元以外的细胞：在接种 4 天后，更换一半体积的新鲜的完全培养基，之后每三天重复一次。 
对海马神经元：接种三天后，用不含 L-谷氨酸的新鲜培养基更换一半体积的培养基。之后每三天重复一次。 
 
三、分离原代大鼠胚胎神经元 
下列程序推荐用于培养受精 18 天的大鼠胚胎海马神经元和大脑皮层神经元。
1、从受精 18 天的大鼠胚胎中分离大脑皮层和双侧海马。
2、在预置了 Hibernate-E 完全培养基（Thermofisher 公司产品，每对海马 2 毫升）的锥形管中收集所有的组织。放置，直到所有的组织都已解体。 
3、使组织沉积在管的底部,然后小心地去除上清液，只留下刚好可覆盖组织的最少量的培养基。 
4、在不含钙离子的 Hibernate-E 培养基中，使用 2 毫克/毫升过滤灭菌的木瓜蛋白酶溶液，在 30°C 酶解组织大约 30 分钟, 其间每 5 分钟轻摇锥形管以帮助降解。每对海马组织使用 2 毫升酶溶液。
5、加入两倍体积的 Hibernate-E 完全培养基以恢复二价阳离子的浓度，停止酶解。 
6、使未解离的组织沉降至管底（约 2 分钟），然后把上清液转移 到 15 毫升离心管中，以 150 × g 离心 5 分钟。 
7、在 1 mL 神经元完全培养基中重悬沉淀物，取一小份 (例如 10 μL) 进行细胞计数。后续的操作按照“复苏和培养冻存的神经元” 的第 8-10 步骤进行。

四、复苏和培养冻存的神经元 
重要提示：原代神经元细胞将会贴附在裸露的塑料或玻璃表面，建议事先用神经元完全培养基冲洗所有的塑料和玻璃器皿的内表面， 以获得最高的回收率和产量。由于细胞从冻存状态复苏时极其脆弱，请在整个操作过程中不要震荡或离心细胞。我们建议每次只解冻一管细胞。务必减少从液氮中转移冻存管到 37°C 水浴中的操作时间。细胞从液氮罐到水浴的运输过程中，可在冰桶中放少量液氮，将细胞置于这个冰桶中来进行。 
1、在解冻细胞之前，用神经元完全培养基冲洗无菌的 15 毫升锥 形管，然后在超净工作台中通风晾干。 
2、从液氮中取出冻存管时可稍微拧松管帽以释放压力，然后再拧紧。 
3、在 37°C 水浴中轻柔搅拌冻存管以快速解冻细胞（小于 2 分 钟） 。当观察到冻存管中只有很少量的冰晶存在时（触摸冻存管仍 然感觉是冷的）从水浴中取出。 
4、在超净工作台中用 70%的异丙醇消毒冻存管。在工作台台面上轻敲冻存管以使管内液体沉降到管底。 
5、使用事先用神经元完全培养基冲洗并干燥过的 1 毫升吸头极其轻柔地将细胞转移到事先冲洗并干燥的 15 毫升锥形管中。 
6、用 1 毫升预热的神经元完全培养基冲洗冲洗冻存管，以每秒一滴的速度极其缓慢地加入到 15 毫升锥形管中的细胞里。每加一滴都轻柔地转动锥形管一次。不要一次即把全部培养基加到锥形管中。 
7、慢慢地逐滴加入另外 2 毫升预热的完全培养基，使管内的液体体积为 4 毫升。用 1 毫升吸头轻柔地混合液体，注意不要造成任何气泡。 
8、用一个事先冲洗干燥过的吸头吸取 10 μL 细胞悬液加入到含有 10 μL 0.4% 台盼蓝的微量离心管中，轻敲管壁以混匀溶液。使用手动的细胞计数方法测定活细胞密度。解冻的细胞的活率应超过 50%。 
9、在已经事先用多聚赖氨酸包被（参见“细胞培养步骤”）的 48 孔板中每孔中接种大约 1 × 10⁵个细胞或按所需的细胞密度接种。 加入预热的神经元完全培养基将细胞悬液稀释到每孔 500 μL。 
10、按照“细胞培养步骤”中的 5-6 步骤进行神经元的培养。在 36°C 至 38°C，含 5%二氧化碳的潮湿环境中培养（使用自然空气也是可接受的，但推荐含 9%氧气和 5%二氧化碳的气体环境） 。
 

产品用途: 本产品供科学研究和生产使用，用于组织和细胞的体外培养。 禁止临床使用。

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