操作步骤: 一、质粒DNA 转染(以24 孔板转染为例): A、细胞接种: 1、 转染前一天对细胞进行转接,每孔接种1.5-2.0×10 5 个细胞,使转染时细胞密度为90%左右,且生长良好(非常重要); 2、 最好在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基,以防转染后孵育阶段细胞密度太大、营养不足导致细胞死亡。 B、PM /DNA转染复合物制备(该步完成后应立即进行转染): 1、在1.5 ml无菌离心管中加入50µl无血清培养基,再加入适量的转染试剂,见附表。用移液器轻轻混匀后在室温静置5分钟。 2、 在1.5 ml无菌离心管中加入50µl无血清培养基,并加入适量的溶液A,轻轻混匀,再加入适量的DNA,见附表。用移液器再次轻轻混匀后在室温静置5分钟。 3、将DNA-培养基混合物滴加至PM-培养基混合物中,用移液器轻轻混匀后在室温静置15~20分钟后,立即转染。注意: PM-培养基混合物和DNA-培养基混合物的混合次序非常重要,切勿颠倒。 注意:离心管最好使用聚丙烯离心管。 C、转染: 1、 将步骤B制备的转染复合物滴加至培养基中,边加边轻轻晃动培养板以使复合物均匀分布。加完后,立即将培养板转入培养箱继续培养。 2.、培养12小时后即可观察,最佳观察或收获时间为24~48小时。 3、PM在完全培养基中仍有较高的转染效率,因此转染前后不需要换成无血清或低血清培养基。 二、siRNA 转染(以24 孔板转染为例): A、 细胞接种: 1、转染前一天对细胞进行转接,使转染时细胞密度为30-50%左右,且生长良好、无支原体污染(非常重要); 2.、最好在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基,以防转染后孵育阶段细胞密度太大、营养不足导致细胞死亡。 B、PM /siRNA转染复合物制备 (该步完成后应立即转染): 1、 在1.5 ml无菌离心管中加入50µl无血清培养基,并添加适量的转染试剂(见下表) 。用移液器轻轻混匀后在室温静置5分钟。 2、在1.5 ml无菌离心管中加入50µl无血清培养基,并添加适量的siRNA(见下表),用移液器轻轻混匀后在室温静置5分钟。 3、将siRNA-培养基混合物滴加至 PM-培养基混合物中,用移液器轻轻混匀后在室温静置15~20分钟后,立即转染。 C、转染: 1、将步骤B制备的转染复合物滴加至培养基中,边加边轻轻晃动培养板。加完后,立即将培养板转入培养箱继续培养。 2、37°C培养24-72h,检测基因抑制效果。如果需要,细胞培养4-6h时可以更换培养基,但不是必须。 3、 PM 在完全培养基中仍有较高的转染效率,因此转染前后不需要换成无血清或低血清培养基。 注意事项: 1、首次转染,请务必进行优化实验,如24孔板质粒转染,每孔质粒用量0.8ug, PM可选择2.0ul、2.5ul、3.0ul、3.5ul进行优化。24孔板siRNA转染,PM 用量2ul,siRNA用量可选10pmol、20pmol、30pmol、40pmol进行优化。 2、在制备DNA或siRNA转染复合物时,应避免制备体系中存在血清,因血清会干扰PM与DNA或siRNA形成复合物 。培养体系中尽量不要添加抗生素,抗生素会导致培养细胞死亡。 3、溶液A仅用于质粒转染,RNA或siRNA转染不需加入溶液A。 4、请注意质粒转染和siRNA转染时对细胞密度和转染试剂用量等条件的差异,不要混用同一条件。 5、如果需要质粒稳转,请在转染24-48h后加入筛选培养基。 6、本产品适合于质粒DNA、siRNA分别独立转染,如需质粒DNA、siRNA共转,请选用核酸共转染试剂(abs60317)。 |