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乙酰辅酶A(Acetyl-Co
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Acetyl-CoA测试盒
583
上海机纯实业有限公司
10管/9样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义:乙酰辅酶A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化,经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水,释放能量用于ATP合成。此外,乙酰辅酶A是合成脂肪酸,酮体,胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。测定原理:苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应,乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比,340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。需自备的仪器和用品:紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制:试剂一:液体10mL×1瓶,4℃保存。试剂二:粉剂×1支,-20℃保存。临用前加入100μL试剂五充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。试剂三:液体4μL×1支,4℃保存。临用前加入100μL试剂五充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。试剂四:粉剂×1瓶,-20℃保存。临用前加入9mL试剂五充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。试剂五:液体10mL×1瓶,4℃保存。工作液的配制:临用前请根据拟用工作液体积(样本数×0.92 m L),将试剂二、三和四按照1:1:90的比例混合,或者直接把试剂二和试剂三加入到试剂四中混匀(可以测定9样);加样前置37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴锅中预热30 min;现配现用;乙酰辅酶A的提取:1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。2、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:1、分光光度计预热30min,用蒸馏水于340nm处调零。2、取920μL工作液和100μL样本至 1mL石英比色皿,混匀,立即记录340nm处20s的吸光值A1和80s时的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
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