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莽草酸脱氢酶活性检测试剂盒 |
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6个月
SD含量测试盒
420
上海机纯实业有限公司
100管/96样
注 意: 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定原理:莽草酸脱氢酶催化莽草酸和NADP产生NADPH,检测340nm下的吸光值增加速率来表示SD活性。
需自备的仪器和用品:紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂组成和配制:提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存;试剂一:液体25mL×1瓶,4℃保存;试剂二:粉剂×2瓶,4℃保存;粗酶液提取:细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。测定步骤:1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。2、样本测定(1)在试剂二中加入10mL试剂一充分溶解混匀,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min,现配现用。(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL试剂二,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。SD活性计算:a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。SD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr(2)按样本鲜重计算:单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。SD(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=643×ΔA÷W(3)按细菌或细胞密度计算:单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。SD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.286×ΔAV反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。b.用96孔板测定的计算公式如下1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。SD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr(2)按样本鲜重计算:单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。SD(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=1286×ΔA÷W(3)按细菌或细胞密度计算:单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。SD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.572×ΔAV反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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