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外切β1,4葡聚糖酶活性检测试
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C1含量测试盒
337
上海机纯实业有限公司
100管/48样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义:C1(EC3.2.1.91)存在于细菌、真菌和动物体内,是纤维素酶系的组份之一,C1催化多聚糖链的末端非还原端释放出纤维二糖和葡萄糖。测定原理:采用3,5-二硝基水杨酸法测定C1催化微晶纤维素降解产生的还原糖的含量。需自备的仪器和用品:酶标仪/可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制:提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存;试剂一:液体6mL×1瓶,4℃保存;试剂二:液体25mL×1瓶,4℃保存;样品测定的准备: 1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。3、血清(浆)样品:直接检测。C1活性计算a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、标准条件下测定回归方程为y = 6.4078x - 0.0673;x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。2、血清(浆)C1活力的计算单位的定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。C1活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷V样÷T =14.305×(ΔA+0.0673) 3、细胞、细菌和组织中C1活力的计算(1)按照蛋白浓度计算单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。C1活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(V样×Cpr) ÷T =14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr(2)按样本鲜重计算单位的定义:每g组织每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。C1活力(μg /min /g鲜重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(W× V样÷V样总) ÷T=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。C1活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.0286×(ΔA+0.0673) 1000:1mg/mL=1000ug/mL;V反总:反应体系总体积,0.11mL; V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,120 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。b.用96孔板测定的计算公式如下1、标准条件下测定回归方程为y = 3.2039x - 0.0673;x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。2、血清(浆)C1活力的计算单位的定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。C1活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反总]÷V样÷T =28.61×(ΔA+0.0673) 3、细胞、细菌和组织中C1活力的计算(1)按照蛋白浓度计算单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。C1活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反总]÷(V样×Cpr) ÷T =28.61×(ΔA+0.0673) ÷Cpr
(2)按样本鲜重计算单位的定义:每g组织每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。C1活力(μg /min /g鲜重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反总]÷(W× V样÷V样总) ÷T=28.61×(ΔA+0.0673) ÷W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。C1活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反总]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.057×(ΔA+0.0673) 1000:1mg/mL=1000ug/mL;V反总:反应体系总体积,0.11mL; V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,120 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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