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胞浆异柠檬酸脱氢酶活性检测试剂
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6个月
ICDHc含量测试盒
134
上海机纯实业有限公司
100管/96样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义:ICDHc(EC 1.1.1.42)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸,同时还原NADP+生成NADPH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH重要来源,在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。测定原理:利用ICDHc催化NADP+还原成NADPH反应,在340 nm下测定NADPH浓度的增加。
所需的仪器和用品:紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制:提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存; 试剂一:液体19 mL×1瓶,4℃保存;试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存;试剂三:粉剂×1瓶,-20℃保存;样本的前处理: 1、细菌、细胞或组织样品的制备:细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。2、血清(浆)样品:直接检测。测定步骤:1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。2、将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解;在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。3、 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL试剂一,混匀后立即记录340nm处20s后吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。注意事项:1、若A2-A1大于0.5,需将酶液用提取液稀释,使A2-A1小于0.5,可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。2、若A2-A1小于0.005,可延长反应时间到5min或10min。
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