全血丙-酮酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶比色法)

全血丙-酮酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶比色法)
产品简介：
丙-酮酸(Pyruvicacid，PA)又称2-氧代丙-酸，是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一，可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，丙-酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。丙-酮酸和乳酸是糖无氧代谢的产物，科研工作者常将二者一起研究，并用二者的比值推算循环衰竭的程度，丙-酮酸检测可采用乳酸脱氢酶催化法、二硝基-苯-肼法等，二硝基-苯-肼法是比较古老的方法，生成有色物质，易于观察，但易受α-酮酸的干扰，特异性差，操作烦琐，目前首-选方法是乳酸脱氢酶催化法。

全血丙-酮酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶比色法)其检测原理是在NADH存在条件下，乳酸脱氢酶(LDH)催化丙-酮酸氧化，生成乳酸和NAD+，在弱碱性条件下平衡偏向丙-酮酸氧化为乳酸的方向驱动反应，通过分光光度计或自动分析仪测定340nm处NADH吸光度的下降速率，计算出丙-酮酸含量，可用于检测全血血浆样品中内源性的丙-酮酸含量。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

自备材料：
1、离心管或小试管
2、蒸馏水
3、比色杯
4、分光光度计或自动分析仪

操作步骤(仅供参考)：
1、配制蛋白沉淀工作液：取1瓶蛋白沉淀剂，直接加入蒸馏水至100ml，充分混匀，即为
蛋白沉淀工作液；4℃避光保存，1周有效，该试剂有一定腐蚀性，请小心操作。
2、配制空白对照液：取配制的1ml蛋白沉淀工作液加入0.67ml蒸馏水(即按3:2比例配制)，混匀，即为空白对照液；4℃避光保存，1周有效。
3、配制标准品工作液：取适量的丙-酮酸标准(100mmol/L)，按0.01ml丙-酮酸标准(100mmol/L)溶解于19.9ml空白对照液的比例稀释标准品，使浓度达到0.05mmol/L，即为标准品工作液-丙-酮酸标准(0.05mmol/L)；4℃避光保存，24h有效。
4、制备无蛋白上清液：抽血前，取试管或离心管编号，分别称重(Wt)并记录，加入6ml蛋白沉淀工作液，再次分别称重(Wm)并记录，冰浴或4℃保存备用；在空腹和休息状态下抽血，不用止血带，不可用力握拳，如果使用止血带，应在穿刺后除去止血带至少等待2min后再抽血，用肝素化的注射器抽血，抽取血液后立即注入预先称量的含有蛋白沉淀工作液(预冷至4℃)的试管或离心管中，每管2ml。(如果用血浆测定，每毫升血中用10mg氟化-钠和2mg草酸钾抗凝，立即冷却样本，在15min内离心。)颠倒混匀3次，不可产生气泡，待试管或离心管的温度与室温一致时，再称重(Wb)并记录。静置20min以上，4000g离心15min，取上清液(即无蛋白上清液)待用，上清液应澄清，如果浑浊，转移上清液至干净试管或离心管后，再次离心。
5、PA加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的PA浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测能设置平行管。
6、PA检测：充分混匀，比色杯光径1cm，分光光度计检测340nm吸光度，室温孵育2min后再读取空白管、标准管、测定管的吸光度，此后每隔1min读1次吸光度，直至读数稳定，分别为A空白2、A标准2、A测定2。

计算：全血丙-酮酸(mmol/L)={(ΔA测定−ΔA空白)/(ΔA标准−ΔA空白}×0.05×D也可根据NADH毫摩尔吸光度计算：
全血丙-酮酸(mmol/L)=(ΔA测定−ΔA空白)×(1.56/6.22)×(D/1)

注意事项：
1、配制的NADHSolution，4℃保存，24h有效。
2、血中丙-酮酸极不稳定，血液抽出后1min就见降低；在蛋白沉淀液上清中的丙-酮酸，可4℃稳定8天左右。
3、如果没有分光光度计，也可以使用酶标仪测定，但我们推荐采用分光光度计，以使操作
系统误差减小到少；一次不应检测过多样品，以免因为时间误差而导致结果差异较大。
4、抗凝剂用肝素钠-氟化-钠较，抗凝血样品置于冰浴中送检，尽快分离出血浆等。
5、草酸抗凝剂对LDH有一定的抑制作用。
6、采用乳酸脱氢酶法检测全血丙-酮酸时，一般不建议采用微板法，由于手工操作差异较大，尤其是该法对操作时间要求极其严格，操作难以标准化、统一化，检测结果不稳定。
7、本法在0~0.25mmol/L范围内呈良线性，本法特异性和干扰特异性较高，抗干扰能力强，α-酮丁酸会产生正干扰，α-酮戊二酸、β-羟丁酸、草酰乙酸、乙酰乙酸和异柠檬酸等均无干扰。