丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏微板法)

丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏微板法)
产品简介：
转氨酶是催化α-氨基酸和α-酮酸之间氨基转换反应的一组酶，丙氨酸氨基转移酶(ALT)旧称谷丙转氨酶(GPT)主要存在于肝细胞浆内，细胞内ALT浓度远高于血清，肝细胞破坏后血清ALT立即迅速升高，因此谷ALT被世界卫生组织推荐为肝功能损害敏感的检测指标。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏比色法)其检测原理是ALT催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移反应，其反应公式如下：


L-丙氨酸+α-酮戊二酸→丙-酮酸+L-谷氨酸。
二硝-基苯-肼与α-酮酸反应生成相应的二硝-基苯腙，在碱性条件下二硝-基苯腙的吸收光谱有差异，酶标仪检测在500~520nm处差异大，以等摩尔浓度计算出丙-酮酸的生成量，进而计算酶的活性。100T该检测试剂盒可检测50个样本(不含标准品)，该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

自备材料：
1、蒸馏水
2、离心管
3、水浴锅或恒温箱
4、96孔板、酶标仪

操作步骤(仅供参考)：
1、准备样品：
①血浆、血清样品：血浆、血清按照常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃保存1个月有效，用于ALT/GPT的检测。
②细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行匀浆，低速离心取上清，-20℃保存1个月有效，用于ALT/GPT的检测。
③(选做)样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的ALT/GPT含量。
2、制作ALT标准曲线：取丙-酮酸标准1支，准确加入丙-酮酸标准稀释液1ml，充分混匀，即配制成丙-酮酸标准(100mmol/L)，4℃保存备用。临用前，按丙-酮酸标准(100mmol/L)：丙-酮酸标准稀释液=1：49的比例混合，即为丙-酮酸标准工作液-丙-酮酸标准(2mmol/L)，以96孔板，按下表制备标准曲线，设定平行检测孔，求平均值。


混匀，向各管中加入苯-肼显色液20ul，混匀，37℃孵育20min，加入ALT显色基液200ul，混匀。室温放置5min，以蒸馏水调零，酶标仪505nm处读取各管吸光度。各管吸光度均减去”0”号管吸光度，所得吸光度差值(纵坐标)与对应的卡门酶活力单位(横坐标)作图。注意：标准品用分光光度计检测参考值在0.3~0.9之间，加入ALT显色基液后其颜色依次为至棕红色，应及时检测，随着时间的延长其颜色会加深，由于检测仪器、操作手法等条件的不同，参考值范围会有波动。
3、ALT加样：按照下表设置对照孔、测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的ALT酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。
4、ALT测定：混匀，室温放置5min，以蒸馏水调零，酶标仪505nm处测定对照管、测定管的吸光度(即为A对照、A测定)，如无505nm可选择500~520nm。
计算：以系列标准孔活力卡门单位为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，以(A测定－A对照)之差值，从标准曲线查得ALT活力卡门单位
参考范围：成年健康人血清ALT：5~25卡门单位/ml

注意事项：
1、苯-肼显色液溶解以后，如果仍然有结晶析出，应过滤后使用或弃用。
2、由于赖氏法的特点，在绘制标准曲线时每个点做3管的重复测定，求出各标准管的
吸光度均值，减去“0”号管吸光度均值，对照赖氏单位绘制标准曲线。
3、血清中ALT活性在室温可以保存2天，4℃保存1周，-20℃保存1个月。
4、成批样本测定时一般无需每份样本都做自身血清对照，以试剂空白管代替即可。
5、对于超过正常范围的血清样本，应该进行复测，复测时每份样本都应做自身血清对照。
6、严重黄疸、脂血或溶血的血清，可能会引起测定管吸光度增高，因此检测该类样本时应
做自身血清标本对照。
7、当样本的酶活力大于150卡门单位时，应将样本进行5~10倍稀释后再行测定。

附录：参考标准曲线范围：测定丙-酮酸标准在2mmol/L时，通过分光光度计测定其吸光度多在0.3~0.9之间，加入ALT显色基液后其颜色依次为至棕红色，应及时检测，随着时间的延长其颜色会加深。测定丙-酮酸标准在0、28、57、97、150卡门单位时吸光度，据此作出其标准曲线如下：

注意：由于检测仪器和操作手法等条件的不同，参考值范围会有波动，该值仅供参考，对于要求精确计算ALT含量的，可以采用标准曲线进行多点重复测定；根据测定经验显示标准品浓度在0.6mmol/L以下，1.8mmol/L以上，标准曲线会有偏差。