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电诱导细胞融合试剂盒
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999
6个月
上海酶联生物科技有限公司
避光低温保存
20T
产品简介:细胞融合(cell fusion)是两个或两个以上细胞融合并形成一个细胞过程。在自然情况下,体内、体外发生的细胞融合的现象称为自然融合;体外培养的细胞可用人工方法诱导相同或者不同细胞间发生融合,称为人工诱导融合。体外培养的单层贴壁细胞或悬浮细胞均可以做融合,但成功概率较大的是单层贴壁细胞。电诱导细胞融合试剂盒(Electrofusion of cell)是 20 世纪 80 年代发展起来的一项生物工程技术,其作用原理是先使细胞在在电场中极化成偶极子,并延电力线成串排列,用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜,促使细胞发生融合。该细胞融合方法具有无毒、融合频率高、易控制等优点。该试剂盒有效成分经严格无菌处理,仅用于科研领域,不用于临床诊断或治疗。 自备材料:1、 BALB/C 小鼠、SP2/0 骨髓瘤细胞2、离心管3、离心机4、RPMI 1640 培养基、胎牛血清5、200 目细胞筛6、显微镜7、细胞电融合仪8、CO2 培养箱9、96 孔、24 孔培养板操作步骤(仅供参考):1、准备细胞:⑴SP2/0 骨髓瘤细胞:融合前,提前 1 天将 SP2/0 骨髓瘤细胞传代,培养至其处于对数生长期。将该细胞收集于无菌离心管中,1000g 离心 8~10min,弃上清液。加入 10ml 无血清 RPMI 1640 培养基,将细胞沉淀悬浮起来备用。⑵淋巴细胞:融合前,取经 3 次用目的抗原免疫的 BALB/C 小鼠脾脏,每次免疫间隔 2~3 周,后一次免疫后 3~4 天处死小鼠,取出脾脏,加入 10ml 无血清 RPMI 1640 培养基,将细胞沉淀悬浮起来备用。⑶饲养细胞:融合前,收集健康的 BALB/C 小鼠腹腔中的腹水,将腹水(巨噬细胞悬液) 1000g 离心 8~10min ,弃上清液。加入 25ml HAT 选择培养液(按 HAT Media Supplement:含胎牛血清的 RPMI 1640 培养液=1:49 配制),混匀,接种到 96 孔或24孔培养板。经培养形成的饲养层细胞,可以辅助新的融合细胞的生长。2、细胞融合:⑴将骨髓瘤细胞和淋巴细胞按 5:1 比例混合,细胞密度为 1.5×107 个/ml,细胞悬液以 1000g 离心 8~10min,弃上清液。⑵将细胞沉淀加入 5ml PM 脉冲缓冲液,1000g 离心 8~10min,弃上清液。重复 1 次该步骤。⑶用少量 PM 脉冲缓冲液重悬细胞沉淀,一般细胞浓度应达到 2×106 个/ml,注入细胞电融合仪的电极小池或融合槽。注意:应根据不同体积的电极小池或融合槽加入细胞悬液,大多数细胞电融合仪的融合容积在 20~4000μl 之间。按如下条件电泳:交流电场频率 1MHz,振幅 250V/cm,时间 30s。在显微镜下观察,看到 80%的细胞已经形成珠串时,立即加穿孔电脉冲,其条件为:脉冲幅度 5kV/cm,时间常数 20ms,脉冲个数 5,间隔 1s。⑷1000g 离心 8~10min,弃上清液。向细胞沉淀加入 25ml HAT 选择培养液,混匀,接种到 96 孔或 24 孔培养板,37℃ 5%CO2 培养 12~24h。3、筛选:细胞融合后 12~24h,将细胞接种到 HAT 选择培养液中,细胞密度达到 60~80% 汇合率之间,容许细胞进一步生长,进行异核体筛选,4~14 天后可观察到大集落的杂交瘤细胞克隆。结果:一般培养 3~5 天后即可见小克隆出现,杂交细胞较大,呈圆形且透明,其他细胞透光性差并逐渐死亡。当培养 8~12 天后,克隆可长至孔底面积的 30~50%,此时可取培养上清液进行抗体检测。一旦检测到分泌预定抗体的克隆,应及时将阳性克隆转种 24 孔培养板进行扩大培养。注意事项:1、应注意无菌操作,避免被微生物污染。2、如需 HAT 选择系列产品,可选择 A Media Supplement(50×)、HT Media Supplement(50×)、HAT Media Supplement(50×)。
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