乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒

乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒

产品简介：
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH或LD)，是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，正常情况下不能透过细胞膜；当细胞受损伤时，膜通透性增强，LDH即被释放到胞外。细胞质内LDH减少，培养液中LDH增多，测定培养液中LDH活性或 LDH 漏出率即可反映药物的细胞毒性。

LDH属于氧化还原酶，能可逆的催化乳酸(L)和酸(P)之间的氧化还原反应。其反应公式：乳酸+NAD+→酸+NADH+H+。其中：L→P 为正向反应；P→L 为逆向反应。

乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒其检测原理是以NAD为受氢体，LDH催化乳酸脱氢生成酸，酸再与二硝基反应生成酸二腙，后者在碱性溶液中呈棕红色，颜色深浅与酸浓度呈正比，可用酶标仪检测440nm处的吸光度，通过公式可以计算出细胞毒性时释放的LDH活性或检测其他样品中的LDH活性。本试剂盒可用于常规的LDH活性的检测，更常用于以LDH释放为指标的细胞毒性的检测。该试剂盒仅用于科研领域。



自备材料：
1、96 孔板培养的待测组细和对照组细胞样品
2、无菌 PBS、培养液、蒸馏水
3、多孔板离心机、96 孔板或离心机、离心管
4、恒温箱或水浴锅
5、酶标仪

操作步骤(仅供参考)：
1、准备样品：
①LDH 释放检测：根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到 96 培养板中，使待检测时细胞密度不超过 90%满。吸去培养液，PBS 清洗一次，加新培养液，并根据实验需要设置相应的背景空白对照孔 A、样品对照孔 B、大酶活对照孔 C、药物处理样品孔 D 等分组，继续培养。待检测前取出细胞培养板，在”大酶活对照孔 C”加入 LDH 释放剂(10×)，加入量为原有培养液体积的 10%，并反复吹打混匀数次，然后继续培养 1H 左右。将细胞培养板用多孔板离心机 400g 离心 5min，分别抽取各孔上清液 30~50μl，加入到一个新的 96 孔板相应孔中，用于后续的 LDH 检测。

②细胞内总 LDH 的细胞毒性和细胞增殖检测：根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到 96 培养板中，使待检测时细胞密度不超过 90%满。加入不同药物处理，并设置适当对照。将细胞培养板用多孔板离心机 400g 离心 5min，吸除培养液，加入 150μl 用 PBS 10 倍稀释的 LDH 释放剂，晃动培养板使充分混匀，然后继续培养 1H 左右。将细胞培养板用多孔板离心机 400g 离心 5min，分别抽取各孔上清液 30~50μl，加入到一个新的 96 孔板相应孔中，用于后续的细胞毒性检测。

③样品准备完毕后可以用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的 LDH 含量。

2、LDH 酶促：按照下表顺序依次加入各溶液，并注意避免产生气泡。如果样品中酶活性过高，可减少样品用量或适当稀释后再行测定。

3、LDH 测定：混匀，室温放置 5min，酶标仪 440nm 处测定各孔吸光度。

计算：
细胞毒性或死亡率=(AD-AB)/(AC-AB)×
如同时检测一已知浓度 c 的 LDH 酶标准品对应吸光度值 AY 和标准空白对照吸光度值 AY0，则可粗略计算出样品中的酶活力：
待测样品中 LDH 活力单位（mU/ml）=(AB-AA)/(AY-AY0)×c
如需准确计算样品 LDH 酶的绝对活性，可用自备的 LDH 标准品及测得的相应吸光度值绘制标准曲线，通过标准曲线相应公式可计算出样品的酶活性。
其中： AA=背景空白对照孔 A 的吸光度
AB=样品对照孔 B 的吸光度
AC=大酶活对照孔 C 的吸光度
AD=药物处理样品孔 D 的吸光度

结果与分析：
通过直接比较每孔 LDH 的活性判定药物或毒物的细胞毒性。LDH 的活性越高，表示细胞膜通透性越高，细胞受损越严重。 

注意事项：
1、培养细胞时要用无血清或低浓度血清的培养液，以排除血清的干扰，否则会有偏差。
2、EDTA 对 LDH 有抑制作用，操作中避免使用或尽量彻底清除含 EDTA 的试剂。
3、LDH 尽可能现取现测，如收集的细胞培养液放置时间较长，可能使 LDH 的活性降低。
4、同一批试验尽量用同一次配置的溶液，溶液的使用量应统一，反应时间也应一致。
5、酶促反应中，上清液取样量以 5~20ul 为宜，。如果样品中酶活性过高，可减少样品用
量或适当稀释后再行测定。
6、显色后应在 15min 内测定完成。
7、碱性显色液有一定腐蚀性，请小心操作。

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