Frdbio® HABA法生物素标记效率检测试剂盒

产品介绍：
2-（4-羟基苯偶氮）苯甲酸(2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid ,英文缩写HABA)可以与亲和素特异性结合，其结合复合物为一种黄色或者橘黄色，在500nm有最大吸光值；但是其结合力远远低于生物素与亲和素的结合，当溶液中存在生物素的时候，生物素会强竞争让HABA解离下来,引起吸光值下降。基于此原理，可以根据500nm吸光值的变化计算出蛋白标记生物素的量（被标记蛋白与生物素的摩尔比）。
生物素标记摩尔比的计算是基于比尔-朗伯定律（Beer–Lambert law），又称比尔定律或比耳定律（Beer's law），是分光光度法的基本定律，即当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度（Absorbance，A）与吸光物质的浓度（Consenreation，C）及吸收层厚度（length，L）成正比, 用公式表示为：A = ε*C* L其中A为光度，ε为摩尔吸光系数,所以此处公式为A 500= ε500 C L（此处ε500=34,000M-1cm-1）
主要组分：         

组分名称（Components）	规格	组分说明
HABA- Avidin混合液(干粉)	1VL	临用前加ddH2O 定容到10ml
PBS(pH7.2)	30ml	100mM   磷酸钠，150mM NaCl

                           
储存条件：
该试剂盒在低温下运输，收到后请置于2-8℃保存，保存时间2年以上。
 
实验操作可以选择分光光度法或微孔酶标板法：
分光光度法：
A． 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯，在500nm波长测量吸光值，记录为A_500(H-A);最好测量三次取平均值；
B． 在比色杯中加入100uL待测的生物素标记蛋白（Biotinylated Protein,简称BP），充分混匀后，在500nm波长测量吸光值，吸光值稳定20秒以上，记录为A_500(H-A-BP);最好测量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)<0.35,请用PBS稀释待测样品，再次重复此步骤。
 
微孔酶标板法：
A.      取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波长测量吸光值，记录为A_500(H-A);最好测量三次取平均值；
B.      在微孔板中加入20uL待测的生物素标记蛋白（Biotinylated Protein,简称BP），震荡或移液器吹打充分混匀后，在500nm波长测量吸光值，吸光值稳定20秒以上，记录为A_500(H-A-BP);最好测量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)< 0.3*A_500(H-A),请用PBS稀释待测样品，再次重复此步骤。
 
 

 
 
案例演示：

以Frdbio超级生物标记试剂盒（货号：ARL0021SK）标记Anti-Covid-19 Spike Mab (货号：nCoV-S-hMab-B)，标记后测算标记比，分光光度计法。

本案例中被标记蛋白为抗体，分子量（MW）为150,000,浓度为5.0mg/mL，A_500(H-A)=1.090，A_500(H-A-BP)=0.585，
抗体摩尔浓度计算：mM /mL=5/150000=3.33*10^-5
ΔA₅₀₀=（0.9*1.090）- 0.585=0.396
生物素摩尔浓度计算：mM /mL=0.396/(34000*1)=1.16*10^-5
抗体：生物素（摩尔比）=(3.33*10^-5)/(1.16*10^-5*10)=1:3.48