一、原理
腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)属于细小病毒科(parvoviridae),病毒颗粒无包膜,结构为直径约20nm的正二十面体,是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链DNA病毒,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染力。通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造,可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体,极大增加了AAV的应用潜力。
研究中采用的重组腺相关病毒(Recombination adeno-associated virus,rAAV)载体是在非致病的野生型AAV的基础上改造的基因表达载体,具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长等特点,已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。
利用AAV载体可实现肝脏细胞广泛表达,还可以结合特异性启动子实现细胞类型的特异性表达,如AAV8型对肝脏有较好的趋向性,特异性启动子TBG可驱动外源基因在肝细胞中特异表达。
rAAV所包含的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因,仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep基因、Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生携带外源DNA的rAAV。rAAV的载体容量是4.7kb,插入外源目的片段大小不超过2.8kb。
表1.AAV靶向不同的器官及组织推荐使用对应血清型,注射方法及剂量
备注:
1. 血清型:同一位置选择不同注射方式,所适用的血清型会存在差异;
2. 注射量:不同文献,病毒供应商不同,滴度不同,剂量会有差异;
3. 以上数据大多查阅文献所得,仅供参考。
二、注射方法
常用的方法有尾静脉注射、腹腔注射及肝门静脉注射。
注意事项:
1)由于心脏血流快,或者由于病毒进入血液系统以后,肝脏的首过效应,使尾静脉注射的病毒不容易富集在心脏(反而在肝脏的富集程度更高),因此相比其他器官,尾静脉注射需要更高的病毒量。
三、应用案例
1)
6-8周龄成年C57BL/6小鼠尾静脉注射1×1011GC的AAV8-TBG-GFP,注射7天后对肝组织切片行GFP免疫荧光染色,结果显示GFP在肝细胞中高效表达。
新生C57BL/6小鼠出生后24小时内颞静脉注射2.5×1010GC的AAV8-TBG-EGFP,7天后对肝组织切片行GFP免疫荧光染色,结果显示GFP在肝细胞中高效表达。
参考文献:Bell P, Wang L, Gao G, et al. Mol Genet Metab. 2011.
2)基因功能研究
构建的病毒载体为AAV2/8-CMV-b-Globin-eGFP-WPRE-hgH polyA-H1-Ephx2-shRNA。Ephx2基因编码可溶性环氧化物水解酶(sEH)蛋白。EGFP在病毒注射后14天在肝脏特异性表达;AAV-Ephx2-shRNA注射2周后选择性地降低肝脏单体sEH的表达。
参考文献:
Qin XH, Wu Z, Dong JH, et al.Cell Rep. 2019.
3)
糖尿病小鼠肝脏H19表达慢性增加
相比于正常饲料喂养(NC)小鼠,高脂饲料喂养(HFD)小鼠体重增加更多,空腹血糖升高,并变得葡萄糖不耐受[葡萄糖耐量试验(GTT)],这些小鼠肝脏中H19表达也增加。这些结果表明肝脏H19表达增加与葡萄糖稳态受损之间存在正相关关系。
肝脏特异性H19过表达促进HGP、高血糖和胰岛素抵抗
为了确定肝脏H19表达增加是否与糖代谢受损相关,小鼠尾静脉注射1×1010GC的AAV8-TBG-H19(AAV-H19)实现小鼠全长H19在肝脏特异性表达,H19功能增强小鼠的空腹血糖和胰岛素水平均升高。H19过表达的小鼠也具有葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗(胰岛素糖耐量试验ITT)。总的来说,这些结果表明肝脏中H19水平升高增加HGP(肝脏葡萄糖生成)并损害葡萄糖稳态。
参考文献:Zhang N, Geng T, Wang Z,et al. JCI Insight. 2018.
4)rAAV在肝脏疾病如肝纤维化治疗中的应用
C57Bl/6J小鼠第一次CCl4注射后1周尾静脉注射4×1011vgAAV8-TBG-FOXA2形成肝细胞特异性FOXA2过表达模型。CCl4注射5周后处死小鼠,免疫荧光和免疫组化检测显示在FOXA2基因传递后明显更多FOXA2染色定位于肝细胞;天狼星红染色显示FOXA2过表达组细胞外基质(ECM)沉积减少(胶原纤维数量减少);同时,FOXA2过表达组小鼠肝脏中羟脯氨酸含量更低;免疫组化、蛋白印迹、定量PCR结果显示FOXA2过表达组小鼠肝脏中促纤维化标志物α-SMA和Col1a1蛋白和mRNA表达水平显著下降,这些结果表明肝细胞中FOXA2的上调显著缓解肝纤维化。
参考文献:Wang W, Yao LJ, Shen W, et al., Sci Rep. 2017.
5)rAAV在代谢性肝病中介导的基因编辑
X染色体遗传的高血氨症是由OTC基因突变引起的。该基因外显子4最后一个碱基发生G—>A的突变,导致RNA剪接不能正常进行,使得mRNA和蛋白表达水平只有正常的5%。这种突变小鼠只能在基础饲料喂养下存活,在高蛋白饲料喂养下会产生高血氨症并致死。研究人员使用分离自Staphylococcus aureus 的Cas9(SaCas9)并基于AAV8(对肝脏有高嗜性)的双AAV系统策略,纠正新生spfash小鼠点突变。spfash小鼠出生后第2天(p2)颞静脉注射AAV8.sgRNA1.donor载体(包含1.8kb OTC供体模板,5×1011GC/只)和AAV8-TBG-SaCas9载体(5×1010GC/只),于3周、8周处死小鼠取肝脏分析。非靶向spfash小鼠出生后p2注射AAV8.SaCas9(5×1010GC/只)和AAV8.control.donor(5×1011GC/只),8周后取肝脏。未处理的WT小鼠和spfash小鼠作为对照组。
免疫组化分析肝脏组织切片OTC表达,结果显示双AAV载体系统介导的基因编辑可高效恢复OTC基因表达,OTC阳性肝细胞明显增多。肝匀浆OTC酶活性测定表示经校正spfash小鼠OTC酶活显著增强。肝组织定量PCR检测到OTC mRNA表达水平上调。均提示双AAV载体系统介导的基因编辑对靶基因具有高的校正水平。
图1.AAV.CRISPR-SaCas9对spfash小鼠肝脏OTC位点的体内基因校正
图2.新生阶段spfash小鼠肝脏OTC表达通过AAV8.CRISPR-SaCas9介导的基因校正得以有效恢复
参考文献:Yang Y, Wang L, Bell P, et al. Nat Biotechnol. 2016.