Cleaved Caspase-3 (Asp175) Ant

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抗体标记简介：
抗体标记是指将标记物（酶，荧光素，生物素等）共价连接到抗体上，与待检测物（如某些特定抗原）特异性反应形成多元复合物，并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上对抗原、抗体反应进行定性和定位研究或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液中的半抗原、抗原进行定性和定量测定。目前抗体标记技术己被广泛用于医学病理学、免疫组织化学、分子生物学、生物制药等领域的分析研究与技术测定，常见的抗体标记技术包括酶标记法，生物素化标记法，荧光素标记法和胶体金标记法等。

常用的抗体标记技术：

1.抗体的酶标记法
通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查，也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。
实验中使用偶联剂使酶与抗体结合，即通过应用单、双或多功能试剂，分别与大分子的抗体所存在的功能性基团发生反应，生成酶—抗体偶联复合物。不同的酶—抗体复合物制备方法中，最广泛应用的戊/二醛法，本法与其它偶联方法相比，具有操作简单、反应条件温和，及实用面广等长处。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

1) 辣根过氧化物酶(HRP)
辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘/酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘/酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与 IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘/酸钠氧化前先用二硝基氟/苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢/化钠稳定Schiff氏碱。

2) 碱性磷酸酶（AKP）
碱性磷酸酶（AKP）用于标记抗体，常用戊/二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊/二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。

2.抗体的生物素化标记
亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。常用的有亲和素--生物素标记法(Labeled avidin biotin，LAB)、亲和素-生物素桥法(bridged avidin biotin, BAB)和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin biotin peroxid ase complex，ABC)。本实验可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合。其后，生物素化的分子可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测。

3.抗体的荧光标记法
荧光抗体标记技术是将荧光素以化学方法与特异性抗体共价结合，形成荧光素-蛋白质结合物（即荧光标记抗体），此结合物仍保留着抗体活性，同时具有荧光素的示踪作用。当它与相应的抗原特异结合后，借助于荧光显微镜观察呈现明亮的特异荧光。实验中常用异硫qing基荧光黄（fluorescein isothiocyanate, FITC）作为标记物，在碱性溶液中，FITC上的化学基团异硫qing基（-N=C=S）与抗体蛋白自由氨基（主要是赖氨酸的ε-氨基）结合，形成荧光抗体，以测定细胞相应抗原的存在。FITC具有很高的量子产量（发射光与吸收光的比值,0 .85），而且形成的偶联物的稳定性很好。FITC是应用最广的荧光染料，流式细胞仪就按FITC的特性，设计了激光波长为488 nm,很接近于FITC的最大激发波长492nm）。

4.免疫胶体金标记抗体及检测抗原
胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能利用到。
胶体金在光镜和电镜中均为有效的标记物，可以检测单一和多重抗原。胶体金在电解质中不稳定，但被蛋白质包被的胶体金是稳定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被胶体金，可作标记二抗进行免疫检测，本方法应用范围广，染色后的样品可以长期保存。

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