CUT&Tag技术由美国Fred Hutchinson癌症研究中心在2019年发表于nature Communications期刊,应用于表观遗传学领域的DNA-蛋白质互作研究新技术,主要用于研究转录因子或组蛋白修饰在全基因组上的结合或分布位点。该技术包括以以下几个关键步骤:
图 1 CUT&Tag基本流程
▲第一步:细胞预处理;
▲第二步:一抗与目标蛋白结合;
▲第三步:二抗与目标蛋白结合;
▲第四步:pA-Tn5酶与二抗结合;
▲第五步:片段化;
▲第六步:构建文库;
在整个实验过程中,因为抗体的引导,pA-Tn5酶只在组蛋白修饰、转录因子或染色质调控蛋白结合的染色质区域进行目的DNA的片段化,同时利用Tn5转座酶特性对片段化DNA直接添加测序接头,并将产物释放到细胞外。由于绝大部分非特异性染色质区域还留在细胞核内,因此整个实验的信噪比大幅提高。同时,整个实验过程在一管完成,在一天内可以完成从细胞到测序文库制备全流程,可实现与单细胞测序平台“无缝”结合。
测序策略
IIIumina平台PE150,数据量6G/样
技术优势
与传统的ChIP-Seq及另一种DPI测序技术CUT&RUN相比,CUT&Tag技术具有以下主要优势:
1、无需甲醛交联,去交联、DNA打断、标记,实验周期更短
在CUT&TAG实验流程中,pA-Tn5酶的使用是一个重要创新,这种融合蛋白既可以实现与二抗的互作,又能够实现对目标区域的直接切割和标记,从而不再需要对细胞进行甲醛交联和DNA片段化,可将整个实验周期缩短至一天。
图2 CUT&Tag与ChIP-Seq及CUT&RUN比较
2、信噪比更高,细胞需求量大大降低
同样由于pA-Tn5酶的使用,CUT&Tag技术可同时完成对目标区域DNA的片段化和测序接头添加,并将片段化产物释放到细胞外。在此过程中,绝大部分非特异性染色质区域还留在细胞核内,因此整个实验的信噪比大幅提高。
图3 使用CUT&Tag、ChIP-Seq及CUT&RUN对多种组蛋白修饰及RNA Pol II的分布进行分析。CUT&Tag在Peak区域展示出远高于ChIP-Seq和CUT&RUN的信号强度,且背景远低于ChIP-Seq
3、重复性好,信号富集强
由于整个实验步骤的减少,相比于ChIP-seq和Cut&RUN,CUT&Tag在重复样本之间表现出更高的数据相似度,可重复性高。
图 4 上图:相关性热图表明,对于H3K4me1这个标记,CUT&Tag的两个重复样品表现出更高的信号组内相关性;下图:在测序数据量相同的情况下,CUT&Tag的Peak region内数据量更多,信号更强
4、能对极少量细胞甚至单细胞进行分析
得益于pA-Tn5酶的高敏感性,CUT&Tag技术可在单细胞水平实现DPI的分析。
图 5 single cell CUT&Tag (scCUT&Tag)实验工作流程
生信分析流程
图6 生信分析流程图
主要分析展示
典型案例
ATAC-seq + CUT&Tag联合应用,揭示肿瘤免疫逃逸新机制。
2020年1月13日,北京大学系统生物医学研究所尹玉新课题组在国际免疫学领域期刊Nature immunology(IF:23.53)在线发表了题为The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity[4]的研究论文,采用ATACseq和 CUT&Tag测序,揭示了磷酸酶PAC1作为T淋巴细胞功能抑制因子,减弱宿主细胞免疫监视功能,促进肿瘤免疫逃逸的作用机制;抑制PAC1通路,可以激活T淋巴细胞的防御功能。该研究利用ATAC-seq数据得到染色质开放性的动态变化,联合CUT&Tag或ChIP-seq(DNA-蛋白质互作研究金标准)分析,进一步明确调控某一生物学过程的关键因子(包括顺式调控元件和转录因子等)的作用方式,为肿瘤治疗提供了潜在的新型药物靶点,具有重要意义。
图7 PAC1在ROS介导的肿瘤浸润淋巴细胞功能障碍中的作用模型
研究思路
1、筛选目标基因:
首先分析癌症基因组图谱(TCGA)中的数据,发现PAC1在功能耗竭的T淋巴细胞中显著上调,且PAC1表达较高的肿瘤患者,其预后较差,进一步锁定研究的目标基因;
2、验证PAC1功能:
体外实验和小鼠模型实验,发现PAC1基因有抑制T细胞增殖和效应功能。进一步使用小鼠模型诱发结肠炎相关癌症实验,发现PAC1能够促进炎症相关肿瘤的发展。最后,研究人员利用PAC1基因敲除小鼠和荷瘤小鼠模型,发现PAC1的缺失增强CD8+ T细胞的效应功能,降低T细胞表面PD-1的表达,促进宿主抗肿瘤免疫应答,从而抑制肿瘤进展和转移。
3、调控机制研究明确:前期大量实验得到PAC1确实与肿瘤逃逸有关,但作用机制不清楚
采用ATAC-seq技术研究染色质开放性,发现PAC1的缺失表达增加了染色质开放性。且H3K27AC(ChIP-seq)数据与ATAC-seq数据一致。
图8 IGV 可视化Gzmb基因座的ATAC-seq覆盖度以及H3K27ac 和CHD4的开放区域景观
利用CUT&Tag技术进一步研究NuRD复合体的核心成分CHD4与DNA的结合谱,发现PAC1的缺失减弱了CHD4与T细胞效应子相关基因位点的结合功能,且CHD4的富集主要集中在转录起始位点及其附近。
图9 TSS附近reads富集图
结论:PAC1作为重要的T淋巴细胞功能抑制因子,通过招募核小体重构和去乙酰化(NuRD)复合体,重塑T细胞的染色质开放性,特异性抑制下游效应性基因的表达,最终促进耗竭性T淋巴细胞的形成,减弱宿主免疫监视功能,促进肿瘤免疫逃逸。抑制PAC1通路,可以激活T淋巴细胞的防御功能,该研究为肿瘤免疫治疗提供了潜在的新型药物靶点。
▲参考文献:
[1] Kaya-Okur, H. S., Wu, S. J., Codomo, C. A., Pledger, E. S., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., ... & Henikoff, S. (2019). CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature communications, 10(1), 1930.
[2] Wu SJ, Furlan SN, Mihalas AB, Kaya-Okur HS, Feroze AH, Emerson SN, Zheng Y, Carson K, Cimino PJ, Keene CD, Sarthy JF, Gottardo R, Ahmad K, Henikoff S, Patel AP. Single-cell CUT&Tag analysis of chromatin modifications in differentiation and tumor progression. Nat Biotechnol. 2021 Jul;39(7):819-824. doi: 10.1038/s41587-021-00865-z. Epub 2021 Apr 12. PMID: 33846646; PMCID: PMC8277750.
[3] Kaya-Okur HS, Janssens DH, Henikoff JG, Ahmad K, Henikoff S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 2020;15(10):3264-3283. doi:10.1038/s41596-020-0373-x.
[4] Dan Lu, Liu L, Sun Y, Song J, Yin Q, Zhang G, Qi F, Hu Z, Yang Z, Zhou Z, Hu Y, Zhang L, Ji J, Zhao X, Jin Y, McNutt MA, Yin Y. The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity. Nat Immunol. 2020 Mar;21(3):287-297. doi: 10.1038/s41590-019-0577-9. Epub 2020 Jan 13. PMID: 31932812.