DNA 6mA 甲基化测序 | 基因活性调控研究
DNA甲基化是最基本的表观修饰方式。在真核生物中,最常见的甲基化修饰是5-甲基胞嘧啶胞嘧啶(5mC)。 相反地,在原核生物中,N6-甲基腺嘌呤(6mA,或m6A)是最普遍的DNA修饰,即腺嘌呤环第6位添加了一个甲基。 目前研究最多的是原核生物DNA的6mA。起初发现6mA在细菌中作为一种限制-修饰系统(RM:restriction-modification system),其限制性内切酶能将外源DNA切断。每种内切酶在DNA上都有一定的结合位点。当菌株自身的DNA也含有这样的结合位点时,则该菌株的甲基化酶就在这些识别位点上将腺嘌呤甲基化,这样,限制性内切酶就不会将自身的DNA降解掉。两方面结合起来,称为限制-修饰系统。后来发现原核生物中的6mA在DNA 错配修复,染色体复制,细胞防御,细胞周期调控,转录等扮演了重要的角色。2012年的一篇 nature biotechnology文章中2,采用三代测序平台Pacbio对大肠杆菌的6mA进行了全基因组层面的筛选,鉴定出近5万个6mA位点,并且拓宽了人们对RM系统的新认知。
技术优势
一站式服务:
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客户只需提供相关样品的基因组DNA,从6mA-IP富集,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程
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优化的实验流程:
6mA-IP的富集效率是决定数据质量的关键,6mA-IP实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程,具有极高的效率和特异性
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严格的质控:
实验的各个关键步骤进行严格的质控,全程保证实验质量,确保客户得到优质的数据
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专业的生物信息学分析:
具有强大的生物信息学团队,能够满足客户的各类深入数据分析需求
科学方案设计
实验流程
目前所能看到的方法大概有4种。主要是:(1)基于免疫沉淀法;(2)限制酶切法;(3)LC-MS/MS法和(4)三代单分子测序法,包括Pacbio平台和Oxford Nanopore平台测序法。
免疫沉淀法
免疫沉淀法大致有两种:6mA-IP和6mA-CLIP-exo。6mA-IP的方法和MeDIP差不多。先是把gDNA打断成200-400bp长度范围的小片段,然后修复末端,加A碱基,加接头;接着变性成单链DNA;然后用合适的6mA的抗体(比如SYSY 6mA抗体,或者Abcam抗体等)做免疫沉淀吸附,富集包含6mA的DNA 片段;最后用来构建文库,上机测序。测序的片段mapping回参考基因组,这个时候,出现高深度reads覆盖的区域就包含了6mA位点(参考Figure 3左上角的深度峰图)。 6mA-IP方法的优势是可以对低丰度的6mA做到放大富集,但是有的抗体并不能很好的区分1mA和6mA,而且6mA-IP的分辨率很低,大约在200bp左右。 6mA-CLIP-exo是另外一种分辨率更高的免疫沉淀方法。在gDNA打断后,先用识别6mA的抗体进行孵育;再用254nm的紫外线进行交联和抗原抗体免疫沉淀;然后末端修复,加接头;接下来用外切酶从gDNA片段的5端切割,到6mA位点结束(抗体在这里既起到钓出包含6mA的序列,又起到保护6mA碱基不被酶切的作用)。然后用蛋白酶消化掉抗体,变性,合成第二条链;加第二个接头;最后PCR扩增放大,构建文库,上机测序。6mA-CLIP-exo的分辨率可以达到33bp左右。
免疫沉淀法
限制酶切法的原理是基于某些酶对甲基化位点比较敏感,比如DpnI可以切割5’-G6mATC-3’位点,而DpnII只能切割未甲基化的5’-GATC-3’位点。那么DpnII酶就有作为6mA检测的潜力。 6mA-RE-qPCR方法如Figure 5所示,采用两组对照实验,第一组不用酶切,而第二组用CviAII或者DpnII甲基化敏感酶做酶切实验。这个时候,两组的底物gDNA就出现了差别,前者是所有的目标区都存在,而后者会把非6mA甲基化位点都切断(当然这只是理想状态,事实上酶切实验很难做到这种状态,存在酶切不完整的情形)。后者未切割的片段代表6mA甲基化的部分。然后做qPCR定量分析,6mA的比例通过酶切后的PCR产物/未酶切的PCR产物来表示。
三代单分子测序法
目前已经有多个单分子实时测序技术(SMRT:single molecule real-time sequencing)用来做DNA 6mA检测的成功案例。SMRT测序时,特定单碱基的添加结合时间可以被实时检测到。如果一个碱基被甲基化了,或者同一个碱基类型在不同的部位被甲基化(如4mC和5mC;1mA和6mA),会表现出不同的动力学差异(KV: kinetic viariation),具体体现为脉冲时长的差异。据此可以检测出碱基的甲基化信息。甲基化的A脉冲间隔时间是非甲基化A的5倍以上。SMRT方法具有高效、单碱基分辨率的优势。其缺陷是不能很好的区分6mA和1mA,需要和LC-MS/MS等方法结合确定两种甲基化的相对丰度。另外SMRT需要高深度的数据来检测甲基化。
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