琼脂糖

琼脂糖是由1，3连结的β-D-半乳呋喃糖和1，4连结的3，6-脱水α-L-半乳呋喃糖相间联结而成。琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，极少吸附生物大分子也极少引起其变性，是理想的惰性载体。琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃形成良好的半固体状的凝胶。琼脂糖凝胶是最常用的分离介质，用作电泳和层析载体，分离生物大分子（核酸、蛋白、多糖等）。 琼脂糖凝胶的优点： 1、样品无需预处理，电泳操作简单，电泳速度快。 2、凝胶结构均匀，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 3、凝胶透明无紫外吸收，电泳结果可直接用紫外光灯下监测。 4、易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 琼脂糖凝胶的制备方法： 1、根据电泳需要，配制电泳缓冲液。 2、准确称量的琼脂糖加入三角瓶，加入电泳液（1%琼脂糖凝胶，即为1g琼脂糖，加入100 ml 1×TAE）。总液体量不宜超过三角瓶的50%容积 3、微波炉高火加热至沸腾，保持30秒，戴上防热手套，小心摇动三角瓶，重悬未溶解颗粒，再次高火加热1-2分钟，直至琼脂糖完全溶解。 注：加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。 4、溶液冷却至60℃左右，可加入EB溶液（终浓度为0.5 ug/ml，其它核酸染料也可），并充分混匀。 5、将琼脂糖溶液倒入制胶模中，在适当位置插上梳子。凝胶厚度一般在3-5 mm之间。 6、室温下自然凝固（约30-60分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。 注： 凝胶不立即使用，用保鲜膜将凝胶包好后在4℃保存，可保存2-5天。 琼脂糖浓度与 DNA 分离范围 微波炉溶解琼脂糖时，胶液剧烈沸腾冲溢出三角锥瓶怎么办？ 常见问题及解决办法 1、总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。 2、胶液浓度为2%以上的请设置中火加热。 3、胶液剧烈沸腾时，停止加热，戴上防热手套小心摇动三角瓶，然后再次加热至沸腾，直至琼脂糖完全溶解胶液清澈。 琼脂糖电泳图像背景模糊的原因及解决办法 琼脂糖没有完全溶解会造成电泳图像背景模糊不清。完全溶解的琼脂糖，三角瓶内壁应没有粘附琼脂糖颗粒。 DNA条带模糊，拖尾的原因及解决办法 1、DNA降解。样品应避免放置时间过长，避免核酸酶污染。 2、上样量过多。减少上样量。 3、电泳缓冲液失效。多次使用的电泳缓冲液，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，影响电泳效果。建议更换电泳缓冲液。 4、电泳条件不合适。电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃，超长DNA链，温度应＜15℃。 5、DNA含盐过高。电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 6、蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。 7、DNA变性。电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 DNA条带淡弱或无条带的原因及解决办法 1、上样量不够。增加上样量。 2、DNA降解。避免DNA的核酸酶污染。 3、DNA跑出凝胶。缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。 4、分子大小相近的DNA条带不易分辨。增加电泳时间，使用正确的凝胶浓度。 5、DNA 变性。电泳前请勿高温加热DNA链，用20mM NaCl Buffer 稀释DNA。 6、DNA链超长，常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上分析。 DNA Marker条带扭曲的原因及解决办法 1、配制凝胶的缓冲液和电泳的缓冲液，不是同时配制的。使用同时配制的缓冲液，缓冲液高过凝胶1-2mm。 2、电泳时电压过高。可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm)，等条带出孔后，再调高电压。 3、尽量慢慢加样，等样品自然沉降后再加电压。