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文献和实验【原创】暗室实验(化学发光底物检测方法)及Western Blot实验优化方法
暗室实验 暗室实验的操作流程: 1. 新鲜配制1-2ml工作液(A液与B液1:1或1:40混合配制) 2. 进入暗室,在黑暗的条件下,加入1μl未稀释的二抗(HRP连接物) 3. 混合后,可立即在暗室中观察到蓝色光 暗室实验的注意事项: ? 工作液按正确比例混合,且新鲜配制 ? 在暗室中加入二抗 ? 直接使用未稀释的二抗 ? 加入二抗后,立即观察 注:暗室实验可同时检测底物是否有活性,以及二抗是否有活性。 如果暗室实验结果阴性: 更换其它二抗,再次进行
方法也不同,常用的检测系统有化学发光检测(ECL)和化学显色 DAB 检测系统。 化学发光检测(ECL): 利用 HRP 催化化学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用 X 胶片感光 原理,将结果记录下来。 ECL 显色试剂配制:化学发光底物 A 和 B 按照 1:1 比例等体积混匀。 将混合好的显色底物覆盖印迹膜 1-5 min,黑暗条件下观察荧光效果。 在暗室可用放射自显影胶片或化学发光成像系统记录结果 。 如采用放射自显影胶片,曝光几秒
蛋白质免疫印迹(Western Blot )-底物化学发光 ECL 法
蛋白质免疫印迹(Western Blot )可以:(1)从蛋白质混合物中检出目标蛋白质;(2)定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;(3)用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA 相互作用后续分析。实验方法原理———底物化学发光 ECL 法Western 免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。与 Southern 或 Northern 杂交
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