CRISPR/Cas12a系统

IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)基因编辑系统工具
——crRNA化学定制合成，重组Cas12a核酸酶

 
北京泽平代理的进口IDT（Integrated DNA Technologies）Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）基因编辑系统，提供免费序列设计工具，提供CRISPR-Cas12a（Cpf1）中crRNA（CRISPR-derived RNA）的化学合成定制服务，并生产商品化通用型重组Cas12a核酸酶（Cas12a nuclease，即Cpf1核酸酶，限制性内切酶，基因组DNA双链剪切）、以及增强RNP（ribonucleoprotein，核糖核蛋白复合体）电转染效率的电穿孔增强剂、增强HDR（Homology directed repair，同源重组修复）概率的HDR增强剂、HDR供体DNA的化学合成服务，提供从设计到多重基因组编辑等全套试剂的工具平台，为因物种基因组富含A、T、DNA靶点不合适而无法使用常规IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9系统，提供了更多选择。




 

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IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）概述

IDT的Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统，对crRNA序列进行优化缩短、化学修饰，对Cas12a（Cpf1）核酸酶结构域进行优化，获得了高保真的双链剪切功能，使用时仅需混合crRNA和Cas12a（Cpf1）核酸酶，再通过电穿孔（如Lonza Nucleofector核转染系统）转染RNP，可进行精确地基因编辑操作。

传统构建CRISPR-Cas12a（Cpf1）质粒的方法，质粒大小高达6-10kb，很难转染，而如使用原代细胞等难转染的细胞，转染效率更低。且质粒不断产生CRISPR-Cas12a，使脱靶率显著增加。IDT转染RNP蛋白复合体的方法，通过优化CRISPR-Cas12a（Cpf1）组件，在提升剪切精确性的基础上，提高转染效率、减少细胞毒性、降低脱靶率，进而提高了基因编辑效率。

 

 



 
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）产品
 

1、Cas12a（Cpf1）核酸酶

Alt-R™ Cas12a（Cpf1）核酸酶，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS），经序列优化，提高中靶率，降低脱靶率。V3酶和Ultra酶均可识别TTTV，而Ultra核酸酶增加了对TTTT的PAM（前间区序列邻近基序，protospacer adjacent motif）识别。注：V=A、C、G

货号	产品名称	规格	备注
1081068	Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) V3, 100 µg	100 µg	识别TTTV位点，10 µg/µL，100 µg = 633 pmol
1081069	Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) V3, 500 µg	500 µg
10001272	Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 100 µg	100 µg	识别TTTN位点，N表示A、T、C、G碱基
10001273	Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 500 µg	500 µg
10007804	Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 5 mg	5 mg
10007922	Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 100 µg	100 µg	识别TTTN位点，10 µg/µL，100 µg = 670 pmol
10007923	Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 500 µg	500 µg
10007924	Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 5 mg	5 mg

 

 

2、crRNA（定制）

Alt-R™ Cas12a crRNA，定制合成的crRNA，包含20-24nt的特异性序列（定制）和20nt的通用序列，相比野生型，序列更短，中靶率更高。经化学修饰防止被细胞核糖核酸酶降解。需要与Cas12a（Cpf1）核酸酶结合形成RNP复合体。

货号	产品名称	规格	备注
定制	Alt-R™As Cas12a crRNA，2 nmol	2 nmol	40-45bp，与As.cas12a酶结合使用
定制	Alt-R™As Cas12a crRNA，10 nmol	10 nmol
定制	Alt-R™ L.b. Cas12a crRNA, 2 nmol	2 nmol	40-45bp，与L.b.cas12a酶结合使用
定制	Alt-R™ L.b. Cas12a crRNA, 10 nmol	10 nmol

 

 

 

 
3、电穿孔增强剂

Alt-R™ Cas12a电穿孔Enhancer，是Cas12a特异性的载体DNA，当使用原代细胞或难转染细胞系时，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核转染系统等电穿孔设备的对RNP的转染效率，进而提高实验效率。

货号	产品名称	规格	备注
1076300	Alt-R™ Cpf1 Electroporation Enhancer, 2 nmol	2 nmol	电穿孔增强剂，增强转染效率
1076301	Alt-R™ Cpf1 Electroporation Enhancer, 10 nmol	10 nmol

 
 

4、HDR增强剂

Alt-R™ HDR Enhancer，小分子化合物，可提高同源重组修复概率。在包括贴壁、悬浮的大量细胞系中均有活性，可用于Cas12a（Cpf1）核酸酶、Cas9核酸酶。

货号	产品名称	规格	备注
10007910	Alt-R™ HDR Enhancer V2, 30 µL	30 µL	HDR增强剂，增加同源重组修复倾向性
10007921	Alt-R™ HDR Enhancer V2, 150 µL	150 µL
1081072	Alt-R™ HDR Enhancer, 100 µL	100 µL
1081073	Alt-R™ HDR Enhancer, 500 µL	500 µL

 

 

5、供体DNA（定制）

Alt-R™ HDR供体寡核苷酸：专门为同源重组修复基因敲入开发，具有比标准寡核苷酸更高的稳定性和更高的掺入率。

货号	产品名称	规格	备注
定制	Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol	2 nmol	45-200nt，Alt-R修饰和硫代磷酸酯PS修饰
定制	Alt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol	10 nmol
定制	Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 3 µg	3 µg	非常适合进行段基因组的修改和插入；带修饰双链DNA
定制	Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 10 µg	10 µg
定制	Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 3 µg	3 µg
定制	Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 10 µg	10 µg
定制	Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 3 µg	3 µg
定制	Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 10 µg	10 µg

 

 

 

 

 

IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）实验流程

1、（使用IDT序列设计工具）设计crRNA，使其间隔区（Spacer）序列与DNA靶序列互补，提交给IDT定制合成crRNA；
2、将crRNA与Cas12a（Cpf1）核酸酶混匀，形成核糖核蛋白体（ribonucleoprotein，简称RNP)；
3、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核；
4、通过crRNA的Spacer识别DNA靶序列，通过Cas12a蛋白识别PAM序列，对DNA进行剪切；
5、对DNA断裂处进行修复
①进行非同源末端连接修复(Non-homologous end-joining，简称NHEJ），实现基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列设计工具）设计供体DNA模板，进行同源重组修复（Homology directed repair，简称HDR），实现基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。








 



  

IDT Alt-R™ crRNA序列设计示意图


 

 

 


Cas12a系统和Cas9系统区别和应用

 

IDT Alt-R™ CRISPR		Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统		Alt-R™ CRISPR-Cas9系统
		Alt-R™ Cas12a V3核酸酶	Alt-R™ Cas12a Ultra核酸酶	Alt-R™ Cas9核酸酶	Alt-R™ Cas9切口酶
特点		通用Cas12a酶，富含AT的物种，或使用CRISPR-Cas9有限制	经序列优化的Cas12a酶，比Cas12a通用型性能更佳	通用Cas9酶，易于使用且经济实惠	突变的Cas9酶，保留单链切割能力
PAM识别		TTTV	TTTN	NGG
DNA切割		双链		双链	单链
末端		5’突出		平末端	5’突出/3‘突出
建议用途		无法使用Cas9的实验	需要高基因编辑效率的实验	一般实验	适用于同时使用2种crRNA，各自识别并切割2条链中一条，通过将spacer由20nt提高到40nt，实现更高特异性
规格		100 μg或500 μg
Cas12a+crRNA	crRNA	20-24nt特异性序列（推荐使用21nt），20nt通用序列		\
Cas9+gRNA	crRNA	\		19-20nt特异性序列（推荐使用20nt），16nt通用序列
	tracrRNA	\		67nt通用序列
Cas9+sgRNA	sgRNA	\		19-20nt特异性序列（推荐使用20nt），80nt通用序列，经过序列修饰，不会引起细胞免疫反应，不会激活无关的基因

注：
N=任意碱基
V=A、C、G

 

 


 

参考文献

1.Conformational Activation Promotes CRISPR-Cas12a Catalysis and Resetting of the Endonuclease Activity. Stefano Stella,et al., Cell, Volume 175, Issue 7, 13 December 2018, Pages 1856-1871.e21
2. Switching the activity of Cas12a using guide RNA strand displacement circuits
. Lukas Oesinghaus & Friedrich C. Simmel, Nature Communications volume 10, Article number: 2092 (2019)
3. Sequence-Specific Recognition of HIV-1 DNA with Solid-State CRISPR-Cas12a-Assisted Nanopores (SCAN). Reza Nouri,et al., ACS Sens. 2020, 5, 5, 1273–1280
4. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Xiong Ding,et al., Nature Communications volume 11, Article number: 4711 (2020)
5. Broad-spectrum enzymatic inhibition of CRISPR-Cas12a. Gavin J. Knott,et al., Nature Structural & Molecular Biology volume 26, pages315–321(2019)
6. Structural Basis for the Inhibition of CRISPR-Cas12a by Anti-CRISPR Proteins. HengZhang,et al.,Cell Host & Microbe, Volume 25, Issue 6, 12 June 2019, Pages 815-826.e4
7. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a. Isabel Strohkendl,et al., Molecular Cell,Volume 71, Issue 5, 6 September 2018, Pages 816-824.e3


 

 
 

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