Sortag-IT™ Biotin Labeling Kit

 
Sortag-IT™标记试剂盒是为Active Motif的高特异性AbFlex®重组抗体（rAb）的定点标记而设计的，通过纳入每个AbFlex抗体重链的Sortase标签识别序列（LPXTG）进行标记。将荧光团、酶（HRP、AP）、生物素、肽、DNA、碳水化合物或其他标签直接连接到重链的末端，以确保抗原结合位点仍可用于目标识别。


Sortag-IT™标记试剂盒和Sortase A5标记方案

Sortase A属于在革兰氏阳性细菌中发现的转肽酶家族，可催化聚甘氨酸（G）n标签附着在排序酶识别序列上。Sortag-IT标记试剂盒使用Active Motif的来自Staphylococcus aureus的Sortase A5 pentamutant，其活性明显高于野生型Sortase，可提供更快、更有效的标记反应。只需加入带有聚甘氨酸标签的AbFlex抗体，加入Sortase A5并孵化约1小时。纯化柱用于去除多余的标签，并提供停止液以使Sortase A5失活。标记后的抗体可用于下游分析，也可在4℃下储存3个月。

Active Motif还提供与Sortag-IT标记试剂盒兼容的产品：
○AbFlex®重组抗体（rAb）--从可用的AbFlex抗体列表中选择您需要的抗体，与Sortag-IT标记试剂盒一起使用
○重组Sortase A5蛋白--可单独购买以进行批量连接


Sortag-IT™ 标记试剂盒的亮点
○特定位点的抗体连接确保了标记后的抗原结合位点始终可用；不需要重新验证抗体
○定向标记消除了对二抗的需求，从而节省了宝贵的时间，避免了二抗选择中的反种限制
○可轻松地将任何聚甘氨酸标签连接到Sortase识别图案（LPXTG）上
○Sortase A5五聚体比野生型Sortase更有活性和效率；在大约1小时内对抗体进行标记
○包括纯化试剂


原理

用于AbFlex®重组抗体的Sortag-IT™标记试剂盒
 

Sortag-IT标签套装应与Active Motif的AbFlex重组抗体结合使用。每个AbFlex抗体在每个重链的末端都含有一个Sortase标签序列，用于在每个抗体分子上定点添加最多2个标签（2个是每个抗体理论上可以添加的最大标签数，但是，根据所使用的标签，立体阻碍可能禁止添加2个标签）。

首先，在有Sortase A5酶和基于Ca2+的反应缓冲液的情况下，将Ablex重组抗体与所需的聚甘氨酸标签相结合。接下来，Sortase A5会将聚甘氨酸标签带到抗体上的Sortase识别图案（LPXTG）。然后，Sortase A5将裂解LPXTG序列中苏氨酸和甘氨酸之间的键，形成一个酰基酶的中间体，从而使聚甘氨酸标签得以附着。最后，将标记的AbFlex抗体从游离的标签中纯化出来，用终止液使A5排序酶失活。


验证
每个Sortag-IT标签试剂盒都在功能试验中得到验证，以确认标签的存在。每个特定试剂盒的数据表中都提供了数据。下面是Sortag-IT™ HRP标记试剂盒用于直接将100µg Active Motif的AbFlex® Histone H3K9ac重组抗体与HRP结合的例子。

图1：Sortag-IT标记的Histone H3K9ac-HRP抗体的Western blot。
将8µg丁酸钠处理过的HeLa酸提取物（1号道）和8µg未处理过的HeLa酸提取物（2号道）在4-12%的SDS-PAGE凝胶上以150V电压运行1.5小时。将材料转移到硝酸纤维素膜上，用含有5%牛奶的TBST阻断。然后，在室温下加入1µg/µl组蛋白H3K9ac-HRP共轭抗体1小时。用TBST清洗印迹三次，用Bio-Rad Clarity显影。


试剂盒组分和储存
每个Sortag-IT标记试剂盒提供足够的材料来标记3 x 100 µg AbFlex®重组抗体，且产量大于50%。

• 3 units Sortase A5 enzyme; Store at -80°C
• 1 ml Reaction Buffer AM3: Store at 4°C
• (Gly)₅-Label; Store at varies
• 10 µl Stop Solution AM3; Store at RT
• 3 ea Purification Columns; Store at RT

有关其他产品的详细信息，请下载下方的文件查看。Sortase A5受美国专利保护（专利号9,267,127）。