单细胞 TCR/BCR测序

一、背景介绍
免疫组库(immune repertoire，IR)是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。TCR/BCR是T/B淋巴细胞表面的特征性标志物，作用是识别抗原，基本单位都是由C/V/D/J四个基因簇编码；细胞发育过程中存在复杂的V(D)J重排机制，导致TCR/BCR基因序列多样性极其丰富，这些序列多样性的集合称为免疫组库。


传统的免疫组库研究技术通常是用多重PCR技术或5’RACE扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR3区），再结合高通量测序技术实现，但往往只能检测TCR和BCR一条链的序列信息。10× Genomics单细胞平台，可实现高通量的单细胞转录组和单细胞V(D)J测序；可以将TCR/BCR双链完美匹配，可以细化到单细胞水平，同时获得表达谱信息。



二、技术原理
10× Genomic单细胞免疫组库测序是利用微流控体系，将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生带有UMI和barcode信息的cDNA；液体油层破裂后，cDNA一分为二，一部分用于基因表达文库的构建，一部分用于免疫组库文库构建；其中TCR或者BCR的V(D)J序列通过设计在TCR或者BCR、lg的C区域的巢式PCR引物进行富集。然后使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达和TCR/BCR的V(D)J全长序列的数据，实现在单细胞水平同时对基因表达和免疫组库进行研究。



三、技术优势
通量高：有8通道和16通道的两种型号的芯片，8通道型号的芯片，一次可以实现8个样本同时上机检测，每个通道最高可以实现10000个细胞的捕获；16通道型号的芯片，一次可以实现16个样本同时上机检测，每个通道最高可以捕获20000个细胞
信息全面：可以同时获得单个细胞的mRNA信息和TCR/BCR信息

四、单细胞TCR/BCR解决的问题
1、揭示克隆性、多样性、抗原特异性和细胞环境
2、组装并注释全长V(D)J基因序列
3、从单个T细胞识别α和β链序列，并可匹配TCR/BCR双链
4、可以将TCR/BDR与对应的细胞内的转录组信息进行合并分析

五、应用方向
1、免疫组库可以捕捉肿瘤发生时免疫微环境的变化，寻找免疫治疗的靶点，从而辅助免疫治疗更好的抗击肿瘤
2、器官或者骨髓移植时，经常会诱发宿主排斥反应的发生，从而发生慢性移植抗宿主病，研究其中的免疫发生过程
3、自身免疫免疫性疾病中免疫细胞的作用
4、免疫组库在感染性疾病、抗体开发、用药及疫苗评估等多个方面均有应用价值；例如通过免疫组库研究，可以检测感染类疾病过程中的免疫动态变化
5、在抗体开发方面，可以获得特征性的BCR（Ig）序列，缩短抗体开发的流程
6、针对某种疾病用药后的外周血样本进行评估，确认药物是否激发免疫反应及其功效

六、应用案例



研究目的：利用单细胞RNA测序技术，探索与COVID-19严重程度相关的呼吸道免疫特征
样本信息：不同严重程度的COVID-19患者和健康人的支气管肺泡灌洗液，三名中度COVID-19患者（M1- M3）、六名严重/危重感染患者（S1-S6）、三名健康对照组（HC1-HC3）和一份公开的BALF（HC4）4样本的BALF细胞进行了单细胞RNA测序
测序策略：10x平台，scRNA-seq+scTCR-seq
捕获细胞数：＞66,452 个细胞
结论：在严重的COVID-9患者的支气管肺泡灌洗液中，促炎性单核细胞衍生的巨噬细胞非常多。中度病例的特点是存在高度克隆性扩展的CD8+T细胞；这个支气管肺泡免疫微环境图谱提示了COVID-19发病和康复的潜在机制。



研究目的：利用单细胞RNA测序和单细胞免疫组测序技术，探索异柠檬酸脱氢酶1—IDH1(R132H)特异性肽疫苗治疗弥漫性胶质瘤的免疫应答机制
样本信息：发生假性进展（PsPD）患者中进行了病变切除的患者
测序策略：10x平台，scRNA-seq+scTCR-seq
捕获细胞数：＞16,720 个细胞
结论：单细胞RNA和T细胞受体测序显示，假性进展患者的肿瘤浸润性CD40LG+和CXCL13+T辅助细胞集群由单一IDH1(R132H)反应性T细胞受体主导；表明IDH1(R132H)特异性肽疫苗可诱导特定的治疗性T辅助细胞反应