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北京索莱宝科技有限公司
1x1mL
性能指标 | |
基质 | 高度交联的6%琼脂糖凝胶 |
螯合离子 | Co2+ |
载量(/mL基质) | >20mg 6XHis-tagged protein |
微球粒径(μm) | 45–165 |
最大压力 | 0.3 MPa, 3 bar |
储存缓冲液 | 含 20% 乙醇的1XPBS |
储存温度 | 2°C-8°C |
Reagent | Stability |
Reductants | 10 mM β-mercaptoethanol |
Denaturants | 8 M urea 6 M Gua-HCl |
Detergent | <1% Triton™ X-100 1% NP-40 1% CHAPS ,SDS, sarcosyl |
Other additives | ≤500 mM imidazole at pH7.0 to 8.0 for elution 30% ethanol 20% glycerol 500 mM KCl 1.0 M NaCl 20mM MES 50 mM Tris 50 mM HEPES 50 mM MOPS |
问题 | 原因分析 | 推荐解决方案 |
柱子反压过高 | 填料被堵塞 | 裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22或0.45μm)过滤,或者离心去除。 |
样品中含有高浓度的核酸,加长破碎时间直至粘度降低,或者添加DNase I (终浓度5μg/ml),Mg2+ (终浓度1 mM),冰上孵育10-15 分钟。 | ||
样品太粘稠 | 有机溶剂或者蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。 | |
洗脱组分中没有 目的蛋白 |
蛋白可能是包涵体,没有在上清中 | 可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白,包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。 |
表达量太低 | 优化表达条件。 | |
目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤被洗下来了 | 提高wash Buffer的pH,或者降低咪唑浓度。 | |
目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来 | 降低Elution Buffer的pH值,或者增加Elution Buffer中咪唑浓度。 | |
使用10-100mM EDTA溶液剥离镍离子,同时得到目的蛋白。 | ||
蛋白降解 | 菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。在4°C下进行纯化操作。 | |
洗脱组分不纯(含 有多种蛋白) |
洗杂不彻底 | 增加Wash Buffer体积。 |
样品中含有其他的组氨酸 标签蛋白 |
通过调节pH值,或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段(如离子交换,疏水等)进一步纯化洗脱组分。 | |
填料颜色变浅 | Co离子被剥落 | 参考part3重新螯合钴离子。 |
上样过程中蛋白 发生沉淀 |
操作温度太低 | 室温下进行上样。 |
蛋白发生聚集 | 在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂,如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。 |
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