a. 本体系适用于经过纯化的 PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度,10× Reaction Buffer加入量可适当减少至 2μl。但由于 DNA 聚合酶同时具有外切酶活性,会影响酶切产物,因此如下一步需进行克隆等操作,建议酶切前对 PCR产物进行纯化。 ② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀(切勿涡旋),然后瞬时离心以收集挂壁液滴;
③ 37℃温育 15 min(质粒),或 15~30 min(PCR产物),或 30~60 min(基因组DNA); ④ 80℃温育 20 min 即可使酶失活,停止反应(可选)。
2. 双酶切或多酶切
① 每种快速内切酶的用量为 1 μl,并根据需要适当扩大反应体系; ② 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10; ③ 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同,应先以最适温度低的酶开始酶切,再添加最适温度较高的酶,在其最适反应温度下进行酶切反应。 3. 适用于质粒的扩大反应体系