牛结核分枝杆菌（MB）核酸检测试剂盒（荧光PCR-法）

【产品名称】

通用名称：牛结核分枝杆菌（MB）核酸检测试剂盒（荧光-PCR 法）
Name ：Mycobacterium Bovis Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒

【预期用途】

牛结核病(Bovine tuberculosis，bTB)是由牛型分枝杆菌(Mycobacterium boris)引起的包括人和家畜以及野生动物发病的一种慢性消耗性人兽共患传染病，被国际动物卫生组织(OIE)定为 B 类动物传染病，是一种危害严重的人兽共患传染病， 可以通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而从牛传染到人[1]。结核病为慢性消耗性疾病，感染牛型分枝杆菌的奶牛并不一定马上出现临床症状，牛型分枝杆菌蛋白胶乳凝集方法的建立及应用易被忽视，但奶牛通常会在一定时间后表现出临床症状，    并将病菌传播给群内其他动物。本试剂盒适用于检测气管分泌物拭子、肺组织等样本中的牛结核分枝杆菌，用于牛结核分枝杆菌感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对牛结核分枝杆菌特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对牛结核分枝杆菌的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断[2]。

【试剂组成】

名          称	规         格
酶液	50μL×1 管
MB 反应液	500μL×2 管
MB 阳性质控品	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管

注：

1. 不同批号试剂不能混用。
2. 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列
荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀动物，无菌采集肺病变部位或病变/非病变部位交界处的样品；活动物
灭菌棉拭子沾取气管分泌物，放入无菌试管中

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本
运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）
   1. 样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；气管分泌物取 100μL 提取。

1. 2. DNA 提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的 DNA 提取试剂盒（离心柱提取
法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂	MB 反应液	酶液
用量（样本数为 N）	20μL	1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
 

4. PCR 扩增（核酸扩增区）
   1. 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
   2. 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道

（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

1. 3. 推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	95℃	10min	否
2	40 cycles	94℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

5. 结果分析判定
   1. 结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

1. 2. 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38， 且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；
阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6. 质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7. 检测方法的局限性

• 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
• 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
• 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
• 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
• 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
• 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定   量检测不准确的结果；
• 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

 

【注意事项】

• 所有操作严格按照说明书进行；
• 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
• 反应液应避光保存；
• 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
• 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
• 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
• 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
• 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通   则》进行处理。

【参考文献】

1. Wedlock D N, Skinner M A, Lisle G M, et al. Control of Mycobacterium

bovis infections and the risk to human populations[J].Microbes and Infection,2002,4:471~480.

2. 贾广乐，梅琳等.牛分枝杆菌 TaqMan 荧光定量 PCR 方法的建立.动物检疫学分会 2010 年年会集[M].104~108.