禽流感病毒 H5 亚型（AIV-H5）核酸检测试剂盒（荧光

禽流感病毒 H5 亚型（AIV-H5）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

【产品名称】

商品名称：禽流感病毒 H5 亚型（AIV-H5）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
Name ：Avian Influenza Virus subtype H5 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

禽流感是由Ａ型流感病毒不同亚型引起的一类主要感染禽类的烈性传染病，分为非致病性、低致病性和高致病性三类[1]。其中高致病性禽流感可由 H5 亚型（以 H5N1 为代表）禽流感病毒引起，鸟禽和人类感染后表现不同程度的呼吸道症状甚至死亡， 得到世界卫生组织和粮农组织的高度关注[2]。本试剂盒利用实时荧光PCR 原理，检测 H5 亚型禽流感病毒，对禽流感病毒 H5 亚型引起的流感诊断有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对禽流感病毒 H5 亚型HA 基因高度保守区域设计特异性引物和探针[3]，在反应体系中含禽流感病毒 H5 亚型基因组模板的情况下，PCR 反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。

【试剂组成】

名      称	25T	50T
AIV-H5 反应液	500μL×1 管	500μL×2 管
酶液	25μL×1 管	50μL×1 管
AIV-H5 阳性质控品	50μL ×1 管	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管	250μL ×1 管

注：

1. 不同批号试剂不能混用。
2. 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物， 置于 1mL 50%甘油生理盐水中。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）
   1. 样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

1. 2. 核酸提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按    照试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂	AIV-H5 反应液	酶液
用量	20μL	1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）
   1. 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
   2. 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：

1. 3. 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定
   1. 结果分析条件设定

1. 2. 结果判断

6. 质控标准

7. 检测方法的局限性

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

1. 1. 张桂贤. 新城疫，禽流感H5 亚型（Re-5 株）抗体水平监测[J]. 今日畜牧兽医，2012，(4):38-39.
   2. Hulse-Post D J, Stum-Ramirez K M, Humberd J, et al. Role of domestic ducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza virus in Asia. Proc Natl Acid Sci USA, 2005, 102(30): 10682-10687.
   3. 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 19438.2-2004 H5 亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法[S].