马传染性贫血病病毒（EIAV）核酸检测试剂盒（荧光-PCR

商品名称：马传染性贫血病病毒（EIAV）核酸检测试剂盒（荧光-PCR 法）
Name ：Diagnostic Kit for Equine Infectious Anemia Virus RNA (Real-Time RT-PCR Method)
【包装规格】50T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测的抗凝血等标本中马传染性贫血病病毒 RNA，适用于马传染性贫血病病毒感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。

【检验原理】

本试剂盒用一对马传染性贫血病病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针， 用一步法荧光 RT-PCR 技术对马传染性贫血病病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名         称	规         格
酶液	50μL×1 管
EIAV 反应液	500μL×2 管
EIAV 阳性质控品	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、
eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

无菌采集被检马属动物的抗凝血

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标
本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）
   1. 样本前处理

在室温放置 30~40min，收集中间淡黄色的白细胞层，每管分装 500uL，4000rpm离心 10min，弃上清液，白细胞沉淀-80℃保存备用。。

1. 2. RNA 提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），
请按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂	EIAV 反应液	酶液
用量	20μL	1μL

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）
   1. 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
   2. 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择：

检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。
 

4. 3. 推荐循环参数设置：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号 1 1 cycle 42℃ 20min 否 2 1 cycle 95℃ 10min 否

结果分析判定
 

3 40 cycles 94℃ 15sec 否 55℃ 30sec 是

结果分析条件设定设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

1. 2. 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值
≤38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性； 阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6. 质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7. 检测方法的局限性

• 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
• 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
• 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
• 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
• 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
• 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
• 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

 

【注意事项】

• 所有操作严格按照说明书进行；
• 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
• 反应液应避光保存；
• 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
• 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
• 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
• 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
• 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。