一.细胞介绍
NK-92细胞是从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性外周血单核细胞衍生来的一株IL-2依赖型NK细胞株。NK-92MI细胞是转染得到的源自NK-92细胞的IL-2非依赖的NK细胞株。亲本细胞NK-92通过微粒体基因转化法用逆转录病毒MFG-hIL-2载体携带的人IL-2cDNA进行转化。可能由于载体整合到基因组DNA中,转化是稳定的。这株细胞对很多恶性细胞有细胞毒性;铬释放试验显示它能杀死K562细胞和Daudi细胞。NK-92细胞有以下特征:CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面标记阳性;CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面标记阴性。其亲本IL-2依赖的细胞株NK-92细胞及另一株同样来源于NK-92细胞株的IL-2非依赖的细胞株NK-92CI都可从ATCC得到。NK-92MI细胞和NK-92CI细胞这两个变种都包含、表达并合成hIL-2cDNA。NK-92MI细胞合成的IL-2水平比NK-92CI高,而亲本细胞不合成表达。1998年9月提交到ATCC的培养物污染了支原体,其后代通过BM细胞周期蛋白处理21天消除支原体。处理后6周,用Hoechst染色、PCR和标准培养测试进行支原体检测,结果都呈阴性。
二.细胞特性
(1)来源:男 50岁 外周血
(2)形态:淋巴母细胞样,悬浮生长
(3)含量:>1x10⁶cells
(4)规格:T25瓶或者1mL冻存管包装
(5)用途:仅供科研使用。
三.培养基及培养冻存条件准备
(1)准备MEMα 培养基+0.2mM Inositol(肌醇 )+0.1mM β-mercaptoethanol(β-巯基乙醇 )+0.02mM Folic Acid(叶酸)+12.5% HS(马血清)+12.5%FBS+1%P/S
(2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。
(3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。
四.运输和保存
(1)冻存细胞:1mL冻存管包装干冰运输,收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏,若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染,请立即与我们联系。
(2)复苏好的活细胞:T25瓶复苏的存活细胞常温发货,收到后按照细胞接收后的处理方法操作。
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细胞接收后的处理:
(1)收到细胞后,75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h,若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染,请拍照后及时联系我们。
(2)请在4或5x显微镜下确认细胞状态,同时给刚收到的细胞拍照(10×,20×)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存,作为售后时收到时细胞状态的依据。
(3)贴壁细胞:细胞在37℃培养箱中放置2-3h,显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况,有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下,可去除培养瓶中灌液培养基(若有未贴壁的细胞需要离心回收,重悬打入到原培养瓶中),加入新配制的完全培养基6-8mL,放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上,可以对细胞进行传代处理。传代过程中,若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
(4)注意:运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞,请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1:2传代。
细胞处理:
(1)冻存细胞的复苏:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8mL完全培养基的培养瓶(或皿)中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
(2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法:
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53mM EDTA于培养瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培养箱中消化1-2分钟(难消化的细胞可以适当延长消化时间),然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入3-4mL含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8mL按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力,后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
(3)细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
下面以T25瓶为例:
(1)细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中,可使用血球计数板计数,来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/mL。
(2)1000rpm离心3-5min,去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞,按每1mL冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞/mL分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中,标注好名称、代数、日期等信息。
(3)将要冻存的细胞置于程序降温盒中,-80℃冰箱中过夜,之后转入液氮容器中储存,同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
网址:www.51cells.cn