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- YLKBIO
- YLK-PCR0202
- 国产
- 2025年11月05日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
YersiniapestisProbe qPCR Kit
- 保质期：
1年
- 供应商：
优利科（上海）生命科学有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
50T
鼠疫耶尔森菌也叫做鼠疫杆菌（Yersiniapestis）是鼠疫的病原菌，鼠疫是 一种人兽共患的自然疫源性烈性传染病，人类鼠疫多为疫鼠的跳蚤叮咬而感染， 是我国法定的甲类传染病。此菌引起的是啮齿动物中的自然疫源性疾病，传染性强，病死率高，易酿成大流行，此菌主要累及皮肤和淋巴结，其次为败血症、肺炎、脑膜炎，对人体健康有较大危害，因此快速检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫杆菌)具 有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫杆菌)的试剂盒，它具有下列特点：
- 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
- 引物和探针经过优化，灵敏性高。
- 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
- 特异性高，引物是根据鼠疫耶尔森菌(鼠疫杆菌)高度保守区设计，不会跟其 他病原 DNA 发生交叉反应。
- 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
- 本产品只能用于科研。
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂
样品 DNA。
使用方法
样品 DNA。
稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
- 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
- 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
- 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备
- 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性
- 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
- 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
- 三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
- 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
- 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好
- 后最后加）
成分 样品管
N+2 个PCR 阴
性对照管标准曲线
样品管（2-7 管）2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL 鼠疫耶尔森菌 qPCR 探针 1 μL 1 μL 各 1 μL 鼠疫耶尔森菌探针法 qPCR 引物
混合液2 μL 2 μL 各 2 μL N+2 个待测 DNA 模板 7 μL - - 超纯水 - 7 μL - 第 7 步所得标准曲线样品稀释液
（2-7 号）
-
-各 7 μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3
号管…）
- 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 3 min |
| PCR 反应 （40 个循环） |
95℃ | 15sec |
| 60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的荧光 信号） |
数据处理
- 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值
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文献和实验实时荧光定量 PCR 技术（Quantitative Real-time PCR，简称 qPCR）是在 PCR 扩增过程中，通过实时监测荧光信号的变化，达到对待检测样本中初始模板定量分析的方法。当前 qPCR 技术被广泛应用于临床疾病诊断，动物疾病监测，食品安全分析等领域。随着 2020 年新冠疫情在全球的蔓延，qPCR 技术更是因其检测通量高，速度快，操作简便等优势成为新冠病毒核酸检测的有效方法被众人所熟知。 那么为了得到可靠、准确的检测结果，我们需要注意哪些方面呢？其实决定一次实验成功
扩增曲线的分析攻略。 1、确认软件设置是否正确 对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是，需要看下所选用的试剂中是否含有 ROX 来作为参比荧光染料。Applied Biosystems™ 系列荧光定量 PCR 仪器可以用 ROX 来作为参比荧光染料，用以校正仪器系统以外的物理误差，比如均一化校正由于移液误差或者蒸发导致的批内体积误差等。目前市面上有的的荧光定量 PCR 预混液是不含有 ROX 的，当用此类试剂的时候，应该将 ROX 参比
怎么整板都没有扩增曲线，是哪一步实验出问题了吗？ 这个病原体这段时间怎么经常检出？不会是有污染了吧？ 在您看到荧光定量 PCR 结果的时候是否也有过这样的疑问？隐隐约约感觉实验某个步骤出现问题，却又不知该从何下手。别担心，有「对照精灵」们来助您一臂之力。 荧光定量 PCR 实验，从样本采集到结果分析包含多个实验步骤，针对不同的步骤，可以选择不同的对照对流程进行监控（图 1）。 图 1. 实验流程和常见阴阳性对照种类。 阴性对照 荧光定量 PCR 的灵敏度可以达到 1 拷贝/孔，如此高灵敏
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