- ￥2800
- YLKBIO
- YLK-PCR0196
- 国产
- 2025年11月05日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
Norwalk Virus G1(NV-1) Probe qRT-PCR Kit
- 保质期：
1年
- 供应商：
优利科（上海）生命科学有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
50T
诺如病毒（Norwalk Virus）是单股正链 RNA 病毒，属于人类杯状病毒属，是一种引起非细菌性急性肠胃炎的病毒，如诺病毒感染性强，以肠道传播为主， 通过口-粪传播，以污染的水源、食物、贝类、物品、空气作为主要传播载体。诺如病毒可分为 G I-G 五个基因群，其中引起人类感染的主要是 G1 和 G2 群。因此快速灵敏诊断具有重要意义。本产品以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测诺如病毒 G1 型的试剂盒，它具有下列特点：
- 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。
- 引物和探针经过优化，灵敏性高。
- 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
- 特异性高，引物是根据诺如病毒 G1 型高度保守区设计，不会跟其他病毒的
- 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
本产品只能用于科研。
规格及成分
| 成分 | 十孔盒包装 |
| 探针法 qRT-PCR 缓冲液 | 500μL（蓝盖） |
| 探针法 qRT-PCR 酶混合液 | 100μL（红盖） |
| 荧光PCR 专用模板稀释液 | 1 mL（黄盖） |
| 诺如病毒 G1 型探针法 qRT-PCR 引物混合液 |
100 μL（白盖） |
| 诺如病毒 G1 型 qRT-PCR 探针 | 50 μL（棕色管） |
| 诺如病毒 G1 型探针法 qRT-PCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL) |
50 μL（黄盖） |
| 使用手册 | 1 份 |
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂
样品 RNA。
使用方法
稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能
污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
- 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
- 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
- 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 RNA 的制备
- 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳
- 用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。
Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
- 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
- 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好
- 后最后加）：
探针法 qRT-PCR 缓冲液 各 10 μL 10 μL 各 10 μL 探针法 qRT-PCR 酶混合液 各 2 μL 2 μL 各 2 μL 诺如病毒 G1 型 qRT-PCR 探针 各 1 μL 1 μL 各 1 μL 诺如病毒 G1 型探针法 qRT-PCR
引物混合液各 2 μL 2 μL 各 2 μL 待测样品 RNA 模板 各 5 μL - - 超纯水 5 μL 第 7 步所得标准曲线样品稀释液
（2-7 号）各 5 μL（2
号样到 2 号管，3 号样到3 号管…）
数据处理
- 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 35，则为阳性。
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文献和实验性引物。在引物探针设计时就需要特别考虑扩增片段不能太长，否则那些降解的RNA片段无法被检测到，导致得到的结果不准确。 QIAGEN 全新发布的TaqMan引物探针 - QuantiFast Probe Assays就特别考虑到了 另外由于FFPE样品中的核酸高度片段化且相互交联，抽提得到的RNA中有较多的基因组DNA片段残留，这些残留的gDNA也会被扩增出来，严重影响了基因表达分析结果的真实性。 QIAGEN 全新发布的探针法检测试剂盒 -QuantiFast Probe RT-PCR
，其中规定了确诊病例的诊断方法：具有急性发烧呼吸道疾病的临床症状并且经实时荧光定量PCR （real-time RT-PCR）或病毒分离培养 （viral culture）实验室检测方法检验证实感染A（H1N1）型猪流感病毒。卫生部办公厅于4月30日印发了《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》的通知》[7],其中在实验室检测和病例诊断报告章节，内容如下：检测程序呼吸道标本应首先应用real time RT-PCR方法检测A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照
所特有的，下游引物为通用引物就可以了。 荧光定量PCR检测方法有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。前者需要调整引物浓度以及引物扩增效率，把引物二聚体调整到越小越好；探针法则需要设计荧光探针，这其中由于MGB探针需要碱基数量少和特异性好的特点而被推荐。 探针设计位置有3个：完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉点、完全在RT引物上；这其中又有正向和反向互补两种情况。至于探针要设计在那个位置，根据自己试验情况而定，本人以为效果都差不多。 四、试验操作流程
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