乙型肝炎病毒cccDNA探针法荧光定量PCR试剂盒

乙型肝炎病毒cccDNA探针法荧光定量PCR试剂盒

产品及特点：
乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状 DNA（covalently closed circμLar DNA，cccDNA）是乙肝病毒前基因组 RNA 复制的原始模板，虽含量较少，每个肝细胞内只有约 5～50 个拷贝，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，只有清除了 cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态。因此 cccDNA 的检测具有重要的临床意义。本产品是基于探针法荧光定量 PCR 技术的乙肝病毒 cccDNA 快速检测试剂盒。它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒 DNA 模板。
2. 引物根据 HBV cccDNA 专一区设计，特异性高。
3. 荧光定量 PCR 检测，比常规 PCR 更加灵敏。
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。


规格及成分：

成分	包装
2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色盖）
荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
乙型肝炎病毒cccDNA 探针法 qPCR 引物混合液	100 μL（白盖）
乙型肝炎病毒cccDNA qPCR 探针	50μL（棕色管）
乙型肝炎病毒cccDNA 探针法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖）
核酸释放剂（试用装）	20 次（1mL，绿盖）

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂：样品 DNA。
使用方法：
一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.     标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2.    用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头， 下同）。
3.    在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.    换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用
5.    换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.    重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。


二、样品 DNA 的制备
7.    如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8.    用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 50 次免 DNA 提取的核酸释放剂，本产品的裂解液可以直接作为 PCR 模板，省略了 DNA 提取步骤。其使用手册可向本公司客服索取。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9.    如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.   在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设   置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性 对照管	标准曲线 样品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
乙型肝炎病毒cccDNA 探针法qPCR 探针	1 μL	1 μL	各 1 μL
乙型肝炎病毒cccDNA qPCR 引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 个待测样品 DNA 模板	7 μL	-	-
超纯水	-	7 μL	-
第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号）	-	-	各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号 样到 3 号管…）

11.   盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预热	50℃	2 min
预变性	95℃	5 min
qPCR 反应 （50 个循环）	95℃	15sec
	60℃	60sec（采集 FAM 通道的荧光信号）

四、数据处理
12.   如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13.   如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。