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- YLK-PCR0097
- 国产
- 2025年07月12日
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- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
Mycoplasma spp. SYBR qPCR Kit
- 保质期：
1年
- 供应商：
优利科（上海）生命科学有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
50T
支原体（Mycoplasma）和亲缘关系很近的无胆甾原体（Acholeplasma）、螺旋体
（Spiroplasma）统称霉形体（mollicutes）。霉形体是目前发现的最小的、最简单的原核生物。它们缺乏细胞壁、有变形能力、能通过滤菌器、可在无生命培养基中生长繁殖，成为细胞培养中常见的一种污染源，严重影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。因此，对以支原体为主的霉形体进行早期检测非常重要，它能使得研究人员在污染扩散前快速采取有效措施，减低损失。本产品就是以荧光定量 PCR 技术为基础开发的支原体通用的试剂盒，具有下列特点：
- 免 DNA 制备，直接用裂解液做 PCR，更加简单快捷。
- 覆盖广，根据支原体通用高度保守区设计引物，能检测 40 余种霉形体（包括欧盟药典要求检测的 9 种支原体）。
- 特异性高，跟梭状芽孢杆菌、链球菌和乳酸杆菌等亲缘关系相近的微生物无交叉反应。
- 灵敏高，可检测低至几个拷贝/反应的支原体污染。
- 提供无感染性的支原体阳性对照，能有效避免实验结果的假阳性和假阴性。
- 可用于培养细胞、疫苗、血清、重组蛋白和耗材的污染检测。但不能用于临床诊断。
- 本产品足够至少 50 次 20 μL 体系的荧光 PCR 检测。
规格及成分：
| 成 份 | 包装 |
| 2×qPCR MagicMix | 0.5 mL（棕色） |
| 荧光 PCR 专用模板稀释液 | 1 mL（黄盖） |
| 支原体通用染料法 qPCR 引物混合液 | 100 μL（白盖） |
| 支原体通用染料法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) |
50 μL（黄盖） |
| 核酸释放剂 | 1mL（绿盖） |
| 使用手册 | 1 份 |
运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂：样品 DNA。
使用方法：
一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能
污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，
下同）。
- 在7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
- 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送 1ml免DNA 提取的核酸释放剂，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR 模板，省略了 DNA 提取步骤。其使用手册可向本公司客服索取。
三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果进行定量分析，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则 6 个标准曲线样品只选一个做（可以选 4 号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。
10. 在标记管中按下表加入各成分：
| 成 份 | N+2个样品管 | PCR阴性对照管 | 标准曲线 样品管（2-7 管） |
| 2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 支原体通用染料法 qPCR 引物混 合液 |
2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 自备 10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 个待测样品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
| 自备超纯水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
| 第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号） | 不加 | 不加 | 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3号管…） |
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用ROX，则用水替代。
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。
四.荧光定量 PCR 反应参数：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预热 | 50℃ | 2 min |
| 预变性 | 95℃ | 10 min |
| PCR 反应 （40 个循环） |
95℃ | 15 sec |
| 60℃ | 1 min（采集 SYBR 通道的荧 光信号） |
|
| 按仪器预设程序进行溶解曲线分析 | ||
四 数据处理
12. 设定 60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。
13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
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