- ￥1896
- 博尔森生物
- BES2117PCR
- 中国/上海
- 2025年12月25日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
999
- 保质期：
12个月
- 供应商：
上海博尔森生物科技有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
48T
产品说明
致病微生物检测系列基于独特的恒温荧光检测技术，可针对食品、动物产品等样品中致病微生物的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于对肠出血性大肠杆菌 O104 的检测，检出限为 10³ CFU/ml。
产品组成（48 测试）
适用仪器
Dhelix-Q5、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C 等恒温荧光检测仪，ABI 7500，ABI StepOne，LightCycler480，CFX 96 等荧光 PCR 仪。
自备耗材和仪器
①灭菌 1.5mL 或 2.0mL 离心管；②灭菌 0.2mL PCR 管或八联管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，
100-1000μL）及配套灭菌吸头；⑤离心机；⑥涡旋混匀器；⑦金属浴
注意事项
1. 本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1） 第一区：试剂准备区。
2） 第二区：样本制备区。
3） 第三区：扩增及产物分析区。
分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3. 严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4. 反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5. 反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6. 不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
7. 检出限为 10³ CFU/ml是以 1 ml 10³ CFU/ml增菌液离心后收集菌体再提取的细菌基因组 DNA作为模板。
样品处理
参照 《SN/T 3994-2014 动物产品中肠出血性大肠杆菌 O104:H4 检疫技术规范》中的 5.2 处理样品，对样品进行前增菌，制备的菌液保存待用。详细步骤请按照标准操作。
样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在 2℃~4℃保存 18h。以无菌操作取检样 25g（ml）加入到含有225ml BPW 的无菌均质袋中，在拍击式均质器上连续均质 1min~2min；或放入盛有 225ml BPW 的无菌均质杯中，8000 rpm/min～10000 rpm/min 均质 1min~2min。无菌操作将样品转至 500mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36℃±1℃培养 18h~24h。
实验操作
将试剂完全解冻，各组分离心30s。
1. 试剂配制（试剂准备区，放置于冰盒中进行）：
若有N 个待检样品，则参照下表，按照 N+2 个数量计算各组分用量（N 个待检样品+1 个阴性对照+1 个阳性对），将反应液置于0.6ml 或者1.5ml 离心管中，涡旋混匀，离心30 秒，分装于0.2ml PCR 管中，并向每管加入1滴C-I（约 20μl）。
2. 模板制备（样本制备区）
建议使用试剂配套细菌组 DNA 提取系列产品，具体过程详见产品说明书。
3. 添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）
向步骤 1 中已含有混合液的 PCR 管中分别加入 2 μL 模板，顺序为待测样品模板、阳性对照 PG- O104-I（阴性对照管无需额外加入模板），离心 30 秒，立即进行扩增反应。
4. 扩增反应（扩增及产物分析区）
①恒温仪器 63℃条件下反应 45 min。待仪器升温至 63℃后，新建程序，设置实验名称及反应时间，将步骤3中离心后的 PCR 反应管放入恒温荧光分子检测仪，点击开始检测。 ②若使用荧光定量 PCR 仪，则荧光基团选择 AM，淬灭基团选择 None，将 63℃ 15 s，63℃ 45 s 作为一个循环，于 63℃ 45 s 处收集荧光信号，45 个循环。
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
结果判定
①仪器自动判定结果，若显示示“阳性”或“＋”，则样品中含有肠出血性大肠杆菌 O104；若显示“阴性” 或“－”， 且没有出现 S 型扩增曲线，则样品中不含有对肠出血性大肠杆菌 O104 或含量低于检出限。
②在荧光定量 PCR 仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线，则样品中含有肠出血性大肠杆菌 O104；若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有肠出血性大肠杆菌 O104 或含量低于检测限。
NG 反应管结果显示“阴性”，PG 反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
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文献和实验的作用——他们通过将引发此次疫情的O104：H4型肠出血性大肠杆菌 与2001年采集自一名溶血性尿毒症（HUS）体内的O104：H4型肠出血性大肠杆菌进行基因对比后，发现，两种菌株并非同源，引起此次德国EHEC暴发的O104:H4菌株来自一种肠聚集性大肠杆菌EAEC O104:H4 55989菌株的变异，其中还掺杂了一种目前未知的由志贺毒素产生的O104：H4菌株。 在这一场“战役”中，Harmsen教授主要采用的就是新一代测序 技术，他说，“至今，新一代测序技术已经遍布全球上百
的CaCl2 低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2）此时加入DNA，Ca 2 又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；3）经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg 2 的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl
能够吸收l噬菌体DNA，此后不久，Cohen等人用此法实现了质粒 DNA转化 大肠杆菌 的感受态细胞，其整个操作程序为：1)将处于对数生长期的细菌 置入0℃的CaCl2 低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2 使细胞膜 磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态;2)此时加入DNA，Ca 2 又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶 (DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌 细胞膜 的外表面上;3)经短暂的42℃热脉冲处理
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