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HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit
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有效期1年
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
-20℃保存
100T
产品信息
产品描述
HEK293细胞残留DNA检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的HEK293宿主细胞DNA残留片段含量的试剂盒。
本试剂盒采用qPCR荧光探针原理,专一快速的检测HEK293细胞的残留DNA,其最低检测限可以达到fg水平;UDG酶和dUTP的配合使用可以消除扩增产物带来的污染。试剂盒配套有HEK293 DNA Control(DNA定量参考品)。本试剂盒需要与宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461/18462)配套使用。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 产品编号/规格 | |
41302ES50(50T) | 41302ES60(100T) | ||
41302-A | HEK293 qPCR mix (UDG plus) | 0.8 mL | 1.6 mL |
41302-B | HEK293 Primer&probe mix | 200 μL | 400 μL |
41302-C | DNA Dilution Buffer | 2×2 mL | 4×2 mL |
41302-D | HEK293 DNA Control(30 ng/μL) | 25 μL | 50 μL |
【注】:本试剂盒不含ROX参比染料,若您目前使用的Real Time PCR扩增仪需要添加ROX参比染料,推荐您购买本公司的50× ROX Reference Dye(Cat#10200ES)。
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃储存,有效期1年。收到货后,建议将D组分HEK293 DNA Control储存于-80℃,其它组分储存于-20℃。
注意事项
1)加样和配液步骤尽量都在冰上操作。
2)每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。
3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
4)本产品仅作科研用途。
使用方法
一、HEK293 DNA Control的稀释和标准曲线的制备
用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer将HEK293 DNA Control进行梯度稀释,稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。
具体操作如下:
1. 将试剂盒中的DNA Control和 DNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 s。
2. 取6支干净的1.5 mL离心管,分别标记为 3 ng/μL,①,②,③,④,⑤。
3. 在标记为3 ng/μL的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL DNA Control,即稀释为3 ng/μL,振荡混匀后短时间快速离心10 s,该浓度可分装置于-80℃短期保存(不超过3个月),使用时避免反复冻融。
4. 在 ①,②,③,④,⑤ 管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer,再进行梯度稀释,稀释方法如下:
稀释管 |
稀释比例 |
终浓度 |
① |
10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer |
300 pg/μL |
② |
10 μL ①+90 μL DNA Dilution Buffer |
30 pg/μL |
③ |
10 μL ②+90 μL DNA Dilution Buffer |
3 pg/μL |
④ |
10 μL ③+90 μL DNA Dilution Buffer |
300 fg/μL |
⑤ |
10 μL ④+90 μL DNA Dilution Buffer |
30 fg/μL |
【注】1)每个浓度做3个复孔。该试剂可测试30 fg/μL-3 ng/μL线性范围,如需要,可扩大线性范围。
2)为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA Control分装储存于-80℃。
3)已融化未使用的 DNA Dilution Buffer可保存于2-8 ℃ 7天,如长时间不用请放置于-20 ℃。
4)为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需震荡混匀1 min以上。
二、加样回收质控QC的制备
根据需要设置QC中的HEK293 DNA加样浓度(以制备加 3 pg/μL DNA量的样本QC为例),具体操作如下:
取100 μL待测样本加入1.5 mL干净的离心管中,再加入10 μL②,混匀,标记为加样回收QC。
加样回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备加样回收QC纯化液。
三、标准品回收质控QC的制备(可选)
根据需要设置QC中的HEK293 DNA标准品浓度(以加 3 pg/μL DNA 标准品为例),具体操作如下:
取100 μL 3 pg/μL定量参考品的稀释液加入1.5 mL干净的离心管中,标记为标准品回收QC。
标准品QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备标准品QC纯化液。
四、阴性质控NC的制备
根据实验设置阴性质控,具体操作如下:
取 100 μL 样本基质溶液(或DNA Dilution Buffer)加入1.5 mL干净的离心管中,标记为阴性质控NC。
阴性质控NC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NC纯化液。
五、反应体系
组分 |
体积(μL) |
HEK293 qPCR mix |
16 |
HEK293 Primer&probe mix |
4 |
DNA template |
20 |
总体积 |
40 |
【注】1)根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量:qPCR MIX =(反应孔数+2)×40 μL(含有2孔的损失量)。实验中每一个样品模板最好重复做3个以上。
2)加样完成密封好管子后,请先低速离心10 s将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 s以上,完全混匀反应液,再低速离心10 s将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。
下图为参考板位:
该示例表示的是检测5个浓度梯度的 DNA 标准曲线、1个无模板对照 NTC、3个阴性质控 NC、3个待测样本、3个样本 QC和3个标准品QC。每个检测做3个重复孔。
六、扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)
创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。
创建1个检测探针,命名为 HEK293-DNA,选择报告荧光基团为FAM,猝灭荧光基团为none。
在Assign target (s) to the selected wells面板中,将标准曲线孔的Task一栏设置为Standard,并且在Quantity 一栏分别赋值为300000、30000、3000、300、30(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的sample name一栏中命名为300 pg/μL,30 pg/μL,3 pg/μL,300 fg/μL,30 fg/μL;将无模板对照 NTC 孔的Task一栏设置为NTC;将阴性质控NC孔、待测样本孔、样本QC孔的Task一栏设置为Unknown,并且在相应的Sample Name一栏中命名为NTC、NC、YP、QC,之后点击 。
4. 扩增程序设置:设置反应体积 40 μL。
循环步骤 |
温度(℃) |
时间 |
循环数 |
扩增产物消化 |
37 ℃ |
5 min |
1 |
预变性 |
95 ℃ |
10 min |
1 |
变性 |
95 ℃ |
15 sec |
40 |
退火/延伸(收集荧光) |
60 ℃ |
60 sec |
七、qPCR 结果分析
在 Analysis的Amplification Plot面板中,系统会自动给出Threshold,有时系统给出的Threshold离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节Threshold 至合适位置,点击Analyze。此时可在Multicomponent Plot初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在Analysis的Standard Curve面板中,可读取标准曲线的斜率(Slope)、截距(Intercept)、R²、扩增效率(Eff%)。正常的标曲,R²>0.99;90%≤Eff%≤110%。
3. 在Analysis的View well table面板中,Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本、样本ERC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。
4. NTC在Threshold=20000时,Ct值应大于32,此时检测值<5 fg/μL。
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产品名称 |
货号 |
规格 |
价格 |
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HB211208
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