蔗糖合成酶分解方向 SS-Ⅰ测试盒

 
蔗糖合成酶分解方向 SS-Ⅰ测试盒



微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
蔗糖是源（叶片等）光合产物向“库”器官运输的主要形态。蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是双向反应酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代谢的关键酶之一。研究其分解方向SS-Ⅰ的活性对于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意义。

测定原理：
SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游离果糖和UDPG，采用3,5－二硝基水杨酸法测定还原糖的含量来反映酶活性的高低。    

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰

试剂的组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存；
试剂二： 液体5mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×2支，-20℃保存；临用前每支加入1.2mL试剂二充分溶解待用，现配现用；
试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。

样品测定的准备： 
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。



测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、样本测定，（在EP管中依次加入下列试剂）：

试剂名称（μL）	测定管	对照管
样本	10	10
试剂三	40
试剂一		40

混匀，30℃准确水浴30min后，95℃水浴10min

试剂四

50

50

95℃水浴5min左右，冷却至室温

蒸馏水

400

400

混匀，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm下测定各管吸光值。ΔA=A测定-A对照。每个测定管需要设一个对照管。

SS-Ⅰ活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0012x - 0.0492；x为标准品浓度（μg/mL），y为ΔA。
2、按照蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0012×V反总]÷(V样×Cpr) ÷T 
=138.9×(ΔA+0.0492) ÷Cpr
3、按照样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/g鲜重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0012×V反总]÷(W× V样÷V样总) ÷T
=138.9×(ΔA+0.0492) ÷W
V反总：反应体系总体积，0.05mL； V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0006x - 0.0492；x为标准品浓度（μg/mL），y为ΔA。
2、按照蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0006×V反总]÷(V样×Cpr) ÷T 
=277.8×(ΔA+0.0492) ÷Cpr
3、按照样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/g鲜重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0006×V反总]÷(W× V样÷V样总) ÷T
=277.8×(ΔA+0.0492) ÷W
蔗糖合成酶分解方向 SS-Ⅰ测试盒V反总：反应体系总体积，0.05mL； V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。