Na+k+ ——ATP酶测试盒

 
Na+k+ ——ATP酶测试盒



微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
Na+K+- ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。

测定原理：
Na+K+-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性。

需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
提取液：液体100mL ×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入6mL蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：液体 2mL×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。用时加入3mL蒸馏水， 4℃保存。
试剂五：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂六：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂七：液体25mL×1 瓶，室温保存。
试剂八：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂八 20倍稀释，即取 0.1mL试剂八加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制：按H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配的定磷剂应为浅。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。



操作步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）

	对照管	测定管
试剂一（μL）	65	45
试剂二（μL）	60	60
试剂三（μL）		20
样本 （μL）		100

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min

试剂四（μL）	25	25
样本 （μL）	100

混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液
3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列试剂）

	空白管	标准管	对照管	测定管
0.5μmol/ml标准磷应用液（μL）		20
上清液（μL）			20	20
蒸馏水（μL）	20
定磷试剂（μL）	200	200	200	200

混匀，室温放置30min，在 660nm处，记录各管吸光值。
注意：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒100管保证测 48份Na+K+-ATP酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
3、空白管和标准管只要做一管。

计算 ：
1、血清（浆）Na+K+-  ATPase活力的计算:
定义：每小时每毫升血清（浆）中Na+K+- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力（μmol/h/mL）=[C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷V样÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
2、组织、细菌或细胞中Na+K+- ATPase活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中Na+K+- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(μmol/h /mg prot)=[C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷（Cpr×V样）÷T =7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中Na+K+-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(μmol/h /g 鲜重)=[ C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W× V样÷V样总)÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每1万个细菌或细胞中Na+K+-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(μmol/h /104 cell) =[ C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(500×V样÷V样总)÷T=0.015×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
Na+k+ ——ATP酶测试盒C标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.1mL ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万。