土壤谷氨酰胺酶S-GLS测试盒

 


土壤谷氨酰胺酶S-GLS测试盒
微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
GLS（EC 3.5.1.2）存在于高等动物和某些细菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。

测定原理：
S-GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。
需自备仪器和用品：
台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵、甲苯、冰和双蒸水。

试剂组成和配制：
试剂一×1瓶，15 mL，4 ℃保存；
试剂二×1瓶，40 mL，4 ℃保存；
试剂三×1瓶，60 mL，常温保存；
试剂四×1瓶，5 mL，常温保存；
试剂五×1瓶，3 mL，常温保存；
试剂六×1瓶，3 mL，常温避光保存。

测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零。
2、样品测定（在EP管中加入下列试剂）：

试剂名称（uL）	测定管	对照管
样本	0.1
甲苯	25	25
振荡混匀，室温放置15min
试剂一	100	100
试剂二	400	400

混匀，37℃水浴2 小时

试剂三

525

525

混匀，8000 g，25℃离心10 min；取上清液，依次加入下列试剂

上清液	130	130
试剂四	30	30
试剂五	20	20
试剂六	20	20

土壤谷氨酰胺酶S-GLS测试盒混匀，室温静置15min，420nm处读取测定管和对照管吸光值，
计算ΔA=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。
注意：试剂六如出现沉淀，静置后取上清使用。

酶活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y = 3.8488x+0.0057；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值A。
单位定义：每g土样每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
 S-GLS（nmol/min/g 土样）＝(ΔA-0.0057)÷3.8488×V反总÷W÷T=2.27×(ΔA -0.0057)÷W。
V反总：反应体系总体积：1.05mL；T：反应时间，2h=120min；W：样本质量，g; 1000，μmol到nmol换算系数。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y = 1.9244x+0.0057；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值A。
单位定义：每g土样每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
 S-GLS（nmol/min/g 土样）＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷W÷T=4.55×(ΔA -0.0057)÷W。
V反总：反应体系总体积：0.525mL；T：反应时间，2h=120min；W：样本质量，g; 1000，μmol到nmol换算系数。